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生技概論第三章 RNA及轉錄相關技術 - Coggle Diagram

- - - - 使反義股(anti-sense)的RNA與正股(sense) RNA配對結合
    - - 阻止正股RNA的轉譯發生
    - - 在阻止基因功能及調控等研究上,以反義寡聚核苷酸(anti-sense oligo)的效果最佳
    - - 研究由病毒引起的疾病及癌症
    - - 為了讓這些anti-sense RNA不輕易被水解並穩定持久，又有多種技術可以採用。
        
        舉例: morpholino oligo
        
        組成
        
        加上morpholine的AUCG鹼基之寡聚核苷酸
        
        長度
        
        約18~25個核苷酸
        
        特性
        
        morpholine本身為六角環狀分子
        
        與正股RNA之間的配對效果極佳
        
        不會被核酸酶分解
        
        應用
        
        發育生物學的基因功能研究
        
        如斑馬魚及海膽等水生生物
        
        方式
        
        顯微注射
  - - - 隨著反義RNA技術延伸而來的技術，能更有效地抑制基因的功能。最早在1998年於線蟲中發現此現象
    - - 3.以配對後之RNA分解或阻擋轉錄
      - 2.然後RNA片段會再與相對應的mRNA配對
      - 1.雙股RNA進入細胞後，會被Dicer切成21~23個核苷酸的小片段，稱作siRNA (small interfering RNA)
      - 4.達到阻止基因表現之目的
        
        這也是自然狀況下，許多基因受抑制而靜默(silencing)的原因之一
      - 附圖
    - - 問題
        
        雙股RNA進入後,細胞會將其視為病毒入侵，而啟動防禦機制
      - 解決方法
        
        直接將雙股RNA送入siRNA，這是在操作上異於其他生物之處
    - - 微型RNA microRNA（簡稱miRNA）
        
        負責參與調控其基因表現
  - - - 黏合成雙股RNA
      - 以細胞轉染方法、電穿孔或病毒感染等方式送入細胞
      - 體外合成正股及反義股RNA
    - - 利用基因轉殖，表現出帶有一個loop的shRNA
      - 利用一個內子插在兩個反向的相同cDNA片段之間
      - 或是直接以cDNA和genomicDNA反向相接
      - 轉殖的生物中表現之後，內子被切除，成為有效的dsRNA
  - - - 除了各種現成試劑，生技公司還有其他的產品可讓實驗更有效率
      - 因miRNA與標的mRNA之間並非百分之百互補,所以有更多的實驗室整理規劃miRNA的特性
    - - RNAi表現基因庫(expression library)
        
        其可大量表現許多種siRNA
        
        這些基因庫是根據功能來分類的
        
        舉例
        
        針對激酶表現的基因庫
        
        針對荷爾蒙受體表現的表現基因庫
      - RNAi設計軟體
        
        以運算方式設計出針對各個基因具有高度專一性的siRNAs，以增加成功的機率
        
        Cenix公司提供的軟體,能找出300個以上的基因之最佳siRNAs，並有實驗證明可有效抑制該基因的mRNA達70%以上
      - RNA二級結構預測
        
        Mfold是用來預測RNA二級結構的軟體，可以將RNA折成最佳的
        stem-loop型式
        
        在RNAi技術發展起來之後，也成為研究人員常用的軟體
      - miRNA搜尋軟體
        
        用來找出生物體中可能存在的miRNA
        
        較著名的是MiRscan及miRseeker，其預測出的許多miRNA已被證實確實存在
      - 找尋miRNA的標的基因
        
        根據各個不同的規則，可以預測出miRNA的標的mRNA
        
        例如: miRnada軟體
      - miRNA標的資料庫
        
        預測的miRNA必需要有實驗證實才是真正有用的數據
        
        DIANA TarBase 可分物種搜尋所有已經實驗證明會被miRNA結合
        並受其影響的mRNA
- - - - 可自行切解
        
        RNA的剪接
        
        顯示具有特殊二級結構的RNA
        
        如酵素般自我催化
        
        專有名詞
        
        核醣酵素(ribozyme)
  - - - 可切開特定位置的簡單RNA序列
        
        髮夾型(hairpin)
        
        鎚頭型(hammerhead)
        
        這些特殊的構造常見於一些病毒及類病毒(viroid)的RNA
        
        他們的專一性決定於核醣酵素本身與標的RNA之間的鹼基配對能力
      - 可自行剪接
        
        如第一類內子(intron)
        
        第二類內子(intron)
        
        同時參與DNA移轉(transposition)的機制
        
        主要決定於核醣酵素與其相對DNA之間的配對能力
        
        RNA的剪接即包括自行切解並接合RNA的能力常見於細菌及低等真核生物
      - 以蛋白質作為共因子(cofactor)可切解RNA
        
        RNase P可切解tRNA前驅物(precursor)以形成具功能的tRNA
        
        主要靠引導RNA (guide RNA)與標的RNA之間的配對能力
      - 其他具有此性質的
        
        參與RNA剪接的剪接體(splicesome)
        
        被認為可能有核醣酵素(ribozyme)之存在
        
        更如能依RNA合成指定胺基酸的核醣體
        
        及50多種蛋白質
        
        可能是最複雜的核醣酵素
        
        具有6種RNA
        
        這些都是自然存在的核醣酵素
      - 在核醣酵素的作用機制逐漸瞭解之後，這類不是蛋白質，卻能切核苷酸的核醣酵素之應用發展潛力不可忽視。
      - 科學家們開始製作一些核醣酵素，希望可以將此機制應用於醫療用途，特別是針對病毒的RNA進行切解，以及病人突變基因的mRNA之替換，也就是利用RNA自然剪接原理，將其切解後再接上正確的基因
- - - - 2.比較某基因在不同組織、器官或細胞的轉錄情況是否有差異
      - 分析該基因可能轉錄出的mRNA大小
      - 3.了解該基因之轉錄是否受一些轉錄因子或外加因素影響
    - - 4.以探針進行雜交
        
        在42度C讓DNA探針與RNA樣本雜交，再洗掉未雜交的探針
      - 5.偵測訊號
        
        放射性同位素標記的探針
        
        X光片曝光
        
        非放射性元素標記的探針
        
        進行標記偵測
      - 3.固定
        
        以UV照射或微波爐加熱讓RNA與膜之間產生cross-linking
      - 2.轉漬
        
        藉由毛細現象，真空抽氣轉漬或電流轉漬等，經過變性的RNA，容易黏到尼龍膜或硝化纖維膜上
      - 1.進行RNA變性電泳
  - - - 作用
        
        利用特定轉錄起點產生的RNA量分析不同樣本的轉錄強度，以反應基因表現強弱，也是啟動子因各種因子作用後產生的轉錄能力
      - 原理
        
        S1 nuclease 會切除未與RNA雜交的單股DNA探針以及單股的RNA，只有RNA-DNA雜交的部分會留下，依據剩餘的標記DNA探針大小，可以定出此RNA轉錄起點與終點
    - - 原理
        
        以5'標記的寡聚核苷酸引子與mRNA雜交，再用反轉錄酶依mRNA作出DNA，反應至mRNA的5'端即截止，進行電泳分析後，以製作出的DNA長度可以定出開始轉錄的位置
      - 作用
        
        分析特定RNA的轉錄強度
    - - 原理
        
        利用基因體DNA製作出核醣核酸探針，和表現的mRNA雜交，再以認識單股RNA的核醣核酸酶切割(未雜交的部分會被切除)
      - 作用
        
        1.定出特定mRNA的量
        
        2.定出此RNA的局部構造
        
        3.定出內子、外子的界限、轉錄起點或終點
      - 實驗
        
        方式
        
        以體外轉錄的方式依DNA製作anti-sense的RNA探針，再與RNA雜交，而未雜交的部分則會被RNase A 和T1分解(若包括內子，則不會形成雙股RNA)
        
        結論
        
        得到的RNA進行變性膠體電泳可推知5'端位置及外子位置
        
        用途
        
        比較不同樣本之間的轉錄強度，用來偵測基因上的突變或缺失
- - - - 圖3-3 mRNA的純化細胞中純化出來的RNA中，只有mRNA帶有poly A的尾端，利用這個特徵，可以使用oligo-dT的管柱將其自總體RNA中分離出來。 oligo-dT的管柱是將oligo-dT固著在特殊的介質上，當總體RNA通過管柱之後，只有帶有poly A的mRNA會被oligo-dT抓住，留在管柱中，再洗去管柱中殘餘的其他RNA，再用低鹽將mRNA引流出來，即可得到純化的mRNA。
  - - - 製作特定基因的mRNA供試管內合成蛋白質之用
      - 製作某基因的反義作為核醣核酸探針
      - 製作雙股RNA，先分別合成個別股，然後再黏合
    - - T3 RNA聚合酶
      - SP6 RNA聚合酶
      - T7 RNA聚合酶
      - 原理
        
        使用哪一種噬菌體的RNA聚合酶，都必須配合有該噬菌體的啟動子
        
        這個載體在基因插入處的兩端各有T7及T3的啟動子，以T7 RNA聚合酶可以產生正股的RNA，以T3 RNA聚合酶則會作出反義股的RNA
      - 解釋
        
        細胞內的mRNA均為正股，唯有反義股可以與其互補，因此在此範例中要偵測細胞中A基因之轉錄分佈狀況，應用T3 RNA聚合酶作出標記的反義股當成探針
        
        圖示
- - - - 可用來篩選基因庫、雜交生物晶片等。
      - 全部的mRNA代表著細胞及組織的所有基因表現的情況，當我們構築了一個以此來製出的cDNA基因庫，即可篩選出我們有趣的基因。