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Western Blotting - Vírus da Herpes - Coggle Diagram
Western Blotting - Vírus da Herpes
EXTRAÇÃO
:star:Cultura do vírus - Glicoproteínas (envelope viral)
:star:Extração Mecânica: Ocorreu a centrifugação
:star:Lavagem com solução PBS-T (detergente)
:star:Adicionar efeito tampão de lise
:star:Ondas Sonoras
FRACIONA ELETROFORESE
:star:Separação de proteínas
:star:Utiliza antígeno diluído com tampão de lise
:star:Corrida de proteína
:star:Utilizar placa onde contém gel (padrão) e colocar a amostra do paciente; O gel é conhecido como SDS-PAGE, onde contém poliacrilamida que funciona como uma "peneira". O SDS é conhecido como Aniônico que libera ions com carga negativa.
:star:As proteínas então migram da carga negativa até a carga positiva. As proteínas maiores ficam "presas" no ínicio nas poliacilamida e as menores correm muito mais a placa
TRANFERENCIA PARA MEMBRANA
:star:Transferencia eletroforética conhecida como "sanduiche"
:star:Usa-se duas camadas de papel filtro
:star:Gel
:star:Membrana
:star:Utiliza-se o corante chamado PONCEAU S para melhor visualização para ver se houve a transferência a corrida das proteínas;
BLOQUEIO / DETECÇÃO
:star:Usa-se proteínas BSA - albumina bovina ou leite desnato para bloquear anticorpo, entre meios da corrida de proteínas afim de evitar resultados FALSO POSITIVO;
:star:O método é parecido com ELISA, adicionamos anticorpo primário (se for herpes positivo irá se ligar a membrana);
:star:Lavagem com solução tampão, para retirar o anticorpo que não se ligou;
:star:Adição anticorpo secundário, vem marcado o anticorpo, utiliza-se: QUIMIOLUNESCÊNCIA OU FLOURESCÊNCIA