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生技概論第二章 DNA基本技術 - Coggle Diagram

- - - - 1.分析特定基因是否有缺陷
      - 2.是否帶有轉殖基因
      - 3.作為繁殖特定DNA的樣本
      - 4.製作基因庫
    - - 各種生物細胞或組織
        
        基因體的DNA較長，萃取時不可打斷(這類DNA分子較大，在水溶液中呈黏稠狀)
  - - - 微生物為生產工廠，將直體送入微生物中，大量繁殖質體，並將質體純化出
        
        操作時應避免細菌基因體DNA的汙染
    - - 4.定序
      - 5.供基因轉殖
      - 3.表現RNA＆蛋白質
      - 2.製作突變
      - 6.分析基因表現
      - 1.基因選殖
  - - - 裝有不同DNA的載體，以集合狀態存在(如基因體基因庫、cDNA基因庫)
    - - 1.篩選基因株
      - 2.基因選殖
      - 3.定序
      - 4.研究蛋白質交互作用
  - - - 以機器合成指定序列的寡聚核苷酸
    - - 2.定序引子
      - 3.突變樣本
      - 1.PCR引子
      - 4.探針
  - - - 以特定的DNA或RNA作為模板，再以各類DNA聚合酶製作
    - - 1.探針的合成
      - 2.PCR反應
      - 3.反轉錄cDNA
      - 4.產稱需要的DNA
- - - - 用探針(probe)來雜交(hybridize)基因體中與探針相對應的基因
    - - 確認外加基因是否存在
      - 確認原本基因是否缺失
    - - 進行膠體電泳
      - DNA由鹼處理後造成變性(denature)→形成單股形式
      - 2.進行限制酶的反應,DNA會被切成小片段
      - 轉漬到尼龍膜,再以UV照射,且固定DNA
      - 1.萃取基因體DNA
      - 68℃時以雜交液覆蓋
      - 加入煮沸過的探針,讓其變性成單股
      - 除去未結合之探針,偵測尼龍膜上的探針訊號
      - 是放射性元素標記的探針，就直接以X光片曝光
  - - - 特別偵測有雜交過程的實驗
    - - 放射性
        
        用法
        
        用32P標記在核甘酸中
        
        被合成於DNA分子中
        
        優點
        
        偵測訊號強
        
        可直接以X光片曝光得知結果
      - 非放射性
        
        舉例
        
        biotion
        
        DIG
        
        用法
        
        用32P標記在核甘酸中
        
        被合成於DNA分子中
        
        優點
        
        安全性高
        
        缺點
        
        需進行後續步驟來偵測探針訊號
    - - 全以DNA標記
        
        新合成整段DNA均標記的探針
        
        以隨機引子或PCR的方式合成有標記物的探針
        
        標記物分散在新合成的DNA各處
        
        均需讓引子先能黏上DNA, 必須將模板DNA變性
      - DNA端點標記
        
        原來的DNA上直接標記
        
        探針要有固定的端點,此時並不適合將整段DNA完全標記
        
        常用Klenow fill-in及核酸激酶
        
        Klenow fill-in是將帶有標記的核苷酸原料加入DNA的3'端
        
        核酸激酶是將有標記的核苷酸原料上的標記轉移至DNA的3'端的最後一個核苷酸上
        
        均不用事先將DNA變性
  - - - 通常用於確認該蛋白質具有結合包含特定序列之DNA片段的能力
      - 未加入蛋白質的標記DNA(綠色線)全部跑到膠體的下方
        
        將標記的的特定DNA加入DNA特定蛋白質
        
        被蛋白質結合的DNA會跑比較慢，留在膠體下方
        
        未被結合的DNA跑較快，在膠體下方
  - - - 更進一步確認蛋白質所結合之特定序列
    - - 未加入蛋白質的標記DNA可以被DNasel切成各種大小不一的片段
      - 標記DNA在加入DNA結合蛋白質之後，在結合區域受到蛋白質保護
        
        DNasel無法切割此區域，因此缺少該特並長度的DNA
      - 若加入其他種類的DNA蛋白質，與該DNA無法結合，則無法出現該保護區
      - 若同時加入大量的未標記DNA，會與標記DNA競爭結合蛋白質，因此標記DNA亦不會出現蛋白質保護區
  - - - 欲知某蛋白質在染色絲上的結合位置或分佈
    - - 將細胞中的蛋白質直接與染色絲固定在一起
      - 利用超音波將染色絲打成適當的DNA片段
      - 再利用認識此蛋白質的抗體，將蛋白質及DNA一起抓下來
      - 然後分析這些DNA片段的內容，以及在染色絲上的位置
- - - - 原理
        
        利用電場力移動凝膠基質中的分子。將含有待測分子的樣本放入凝膠上的孔洞中，並施加電場，分子就會以不同的速率通過基質。
      - 附圖
        
        額外
      - 步驟
        
        1.將裝有電泳緩衝液的水平電泳槽接上正負電
        
        4.較小的分子在洋菜精的孔洞中移動較快且遠
        
        3.以緩衝液配製之洋菜精經由加熱凝固後，會出現許多細微孔洞
        
        2.帶負電的DNA會從負極往正極移動
        
        6.最後便可將不同大小的DNA片段分開來
        
        5.大的DNA分子跑得較慢，離原來的凹槽較近
      - 相關專有名詞及實驗器材&用途
        
        3.DNA跑膠色劑(DNA loading dye)
        
        添加於DNA中，其中的染料也會隨著電泳的進行而移動。
        
        含有甘油之類的成分來增加比重，以避免其完全漂浮在緩衝液中
        
        4.DNA染劑
        
        DNA必須經Ethidium Bromide螢光劑染色，並在紫外線照射下才可見到。
        
        帶有螢光的Ethidium Bromide會插入DNA的分子形成染色
        
        生物體的DNA也會被其插入，具有相當的毒性。
        
        其他較安全的DNA染劑
        
        SYBR Green、GelRed等
        
        DNA的分子越大，螢光也越強
        
        2.緩衝液(Running buffer)
        
        需和配製膠體的溶液成分相同。
        
        最常用的有含醋酸的TAE及硼酸的TBE。
        
        主要成分為電解質，以提供導電度
        
        5.分子量標記(Marker)
        
        需要有已知分子量的DNA一起電泳，才能知道DNA的大小
        
        1.膠體濃度
        
        可調整。原則是越大的DNA需要越低濃度的膠體。
        
        較小的DNA需要較高濃度的膠體，通常以0.8~2%之間。
  - - - 以放射性元素標記DNA，再以不同種的特殊化學藥品切出不同長度的DNA。
    - - 以DNA聚合酶進行長鏈合成的反應，將四種核甘酸的類似物在適當時間分別加入四個進行中的DNA合成反應中。
- - - - DNA量不多時
    - - 用已知濃度的DNA & 我們純化的DNA
        
        一起進行膠體電游
        
        經限制酶切過的噬菌體DNA作為分子量標記
        
        由於螢光亮度與分子量成正比
        
        可依瑩光亮度比較出其他未知濃度的DNA量
  - - - 將DNA放入載體，送入噬菌體中，感染細菌宿主，在其體內大量繁殖，再將其分解，釋出更多的噬菌體
      - 做法
        
        篩選，並挑出、繁殖
    - - 將基因體DNA以適當的限制酶切割，接入適當的噬菌體載體中，成為一個基因庫
      - 將基因庫DNA在試管內包裝入噬菌體中，利用噬菌體去感染細菌
      - 噬菌體附著在細菌宿主後，將DNA注入其中，利用其來製造噬菌體病毒的蛋白質，包括病毒的外套蛋白質、各種病毒生長繁殖所需的蛋白質
      - 病毒可大量複製DNA，將細菌的基因體DNA分解，最後此宿主內組合成新的病毒，將其完全瓦解，釋出大量的噬菌體病毒，又可感染新的細菌
      - 圖示
    - - 受限於噬菌體可以裝載的DNA有限，不能滿足所有的實驗需求
      - 有各種改良式的噬菌體載體發展出來
        
        非噬菌體載體的基因庫載體
        
        細菌人工染色體（簡稱BAC）
        
        酵母菌人工染色體(簡稱YAC）
      - 結果
        
        大型的載體可以攜帶更大的DNA片段，在基因體定序上使用十分普遍
    - - cDNA library
      - genomic library
  - - - 第一類
        
        和平時傳統手工製作的純度相當，質體可供初步分析如限制酶切割、PCR及進一步選殖等
      - 第二類
        
        純度較高，可供細胞轉染等需要將DNA送入細胞內的高精密實驗技術之用
      - 成分種類
        
        矽膠
        
        離子交換性質
    - - 利用基因體DNA、RNA、蛋白質及質體各自不同的吸附特性來分離。
    - - DNA在高鹽狀況下會吸附於矽膠上，一般溶劑，只能洗去大分子聚合物，欲將DNA洗下來，只能用溶解DNA的溶液
        
        發展出多種純化DNA的試劑
      - 重點
        
        去除蛋白質
        
        RNA
      - 步驟
        
        將細菌打破，將蛋白質變性沉澱
        
        取上清液通過管柱
        
        以不同濃度的鹽濃度洗去其他非質體的物質
        
        以TE溶液將質體DNA溶出，收集起來
        
        圖示