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TÉCNICAS BIOQUÍMICAS (I)
1.2 Espectrofotometría de absorción
1.2.2 Componentes basicos
1.2.1 Leyes de la absorción
1.2.3 Aspectos prácticos
Manejo
Conectar a la red eléctrica, determinar longitud de onda, colocar la solución que sirve de blanco, se colocan el patrón y las diferencias muestras a valorar.
a) Empleo de blancos
su función es eliminar interferencias de absorción o reflexión por parte de la cubeta y del solvente del cromógeno
Blanco de agua destilada
Blanco de reactivos
elimina interferencias que pueden producir los reactivos.
Blanco de suero
lectura inicial con el suero diluido en la misma proporción en un solvente inerte.
b) Curva de calibración
Gráficos que relacionan absorbancia con concentraciones
Se realizan soluciones con distintas concentraciones pero conocidas
Medimos la absorbancia
Construimos el grafico
c) Empleo de factores de calculo (F)
El factor de calculo
es una cifra ofrecida por el fabricante que utilizaremos para calcular la concentración de un analito o su actividad enzimática.
La concentración del analito mediante un factor se realiza multiplicando la absorbancia obtenida mediante espectrometría -o el incremento de la densidad óptica si es una cinética- por el factor indicado por el fabricante en las condiciones de trabajo establecidas.
d) Causas de error en las determinaciones
Debido a la muestra
Debido a los reactivos
Debidas al material
Debidas a las condiciones de medida y factores ambientales
Debidas al fotómetro
Debida a fenómenos de deriva y ruido
La deriva
es una inclinación hacia una lectura mas alta o mas baja durante un periodo de tiempo, se recomienda cada tres lecturas realizar un blanco.
El ruido
es la falta de estabilidad en los valores proporcionados por el fotómetro.
e) Calibración de los espectrofotómetros
El buen funcionamiento de los espectrofotómetros requiere su calibración y la realización de controles como
Exactitud de medida
Linealidad
Exactitud en la longitud de onda
1.2.4 Análisis de sustancias mediante fotometría de absorción