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TÉCNICAS BIOQUÍMICAS (I)
1.2 Espectrofotometría de absorción
1.2.1 Leyes de la absorción
1.2.2 Componentes basicos
Para realizar medidas de absorción
Fotocolorímetros o fotómetros
Se utilizan
filtros
Espectrofotómetros
Se utilizan
monocromadores
Todos constan de
Fuente de luz o de radiación
Si la fuente de luz emite la radiación electromagnética con un intervalo amplio de longitudes de onda, recibe el nombre de
fuente continua
. Existen distintas lamparas
Lamparas de hidrogeno y deuterio
produce un espectro continuo en la región del ultravioleta -220 a360 nm.
Lamparas de vapor de mercurio
emite un espectro discontinuo o de líneas (313, 365, 405, 436, 546 nm)
Laser
puede producir un haz de luz mucho mas monocromático que cualquier otra fuente de luz
Filamentos de haluros de tungsteno
de mayor duración, producen mas luz entre 360 y 2500 nm.
Filamento de tungsteno
espectro visible y ultravioleta corto, entre 360 y 950 nm.
Rendijas de entrada
Tiene como misión evitar que la luz se dispersa
Monocromador
Se obtiene un haz de luz no estrictamente monocromático, una sola longitud de onda, sino que comprende un intervalo de longitudes de onda que se denomina
ancho de banda
. Cuanto mas estrecho sea el ancho de banda mejor será el monocromador.
Filtros
Transmiten selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás.
Monocromadores
Permite seleccionar una determinada anchura de banda, identificada con un valor promedio que componen el ancho de banda denominado
longitud de onda nominal
Prismas
permite la transmisión de la luz la cual quedara dispersada en mayor i menor medida según la longitud de onda
Rendijas de salida
Tiene como misión evitar que luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.
Compartimiento para colocar la muestra (cubeta)
La cubeta
es el recipiente donde se coloca la muestra y los reactivos. Tiene 1cm de trayecto óptico. Pueden ser de distintos materiales
Las de vidrio se utilizan para el VIS, pero no sirven en el UV
Las de cuarzo sirven para ambas
Las mas usadas son las de plástico (desechables)
Distintas capacidades
0,5 ml microcubetas
0,5 a 2 ml semimicrocubetas
2 ml macrocubetas
Sistema de detección
Consiste en dispositivos que permiten detectar y observar la radiacion despues de pasar por la muestra.
esta basado en el
efecto fotoeléctrico
Tipos
Fotodiodos
el haz de luz incide sobre un diodo, excita un electro dándole movimiento y crea una corriente.
Fototubos y fototubos multiplicadores
La luz incide sobre un cátodo fotosensible que desprende electrones, estos pasan a un ánodo o a varios diodos para amplificar la corriente.
Detectores de carga acoplada
Sistema de registro de datos
Mide la energía eléctrica suministrada por el detector y la cuantifica en una escala de absorbancia, transmitancia o directamente de concentración del analito.
Puede ser galvanómetros o sistemas de lectura digital
Puede procesarse en un pc y pasar a imprimir
Los espectrofotómetros pueden clasificarse
Configuración de un solo haz o diseño de canal sencillo
La luz sigue una única trayectoria entre la fuente y el detector y estos se encuentran alineados.
Poseen lamparas de tugsteno-halogeno para trabajar en el visible
De doble haz
La luz es dividida mediante espejo rotatorio semicircular o mediante un sistema de espejos divisores, semitransparentes. Uno de ellos se dirige a la celda de referencia y el otro hacia la celda de la muestra. Su
ventaja
es que cualquier variación en la intensidad de la fuente afecta simultáneamente a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece inalterada.
1.2.3 Aspectos prácticos
1.2.4 Análisis de sustancias mediante fotometría de absorción