TÉCNICAS BIOQUÍMICAS (I) 1.2 Espectrofotometría de absorción
1.2.1 Leyes de la absorción
1.2.2 Componentes basicos
1.2.3 Aspectos prácticos
1.2.4 Análisis de sustancias mediante fotometría de absorción
La espectrometría de absorción consiste en la medida de la radiación que llega a un detector tras producirse el fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente. 220 y los 800nm.
Características
Facilidad determinaciones rápidas
Especificidad relativamente alta
Sensibilidad relativamente alta
Aplicable en autoanalizadores
La ley de Lambert-Beer relaciona la intensidad de una radiación (Io) que incide en una cubeta con solución coloreada, con la intensidad de la radiación transmitida (It). Matemáticamente se expresa como: A = ε · b · c
ε: El coeficiente de exticion molar o coeficiente de absorcion o absortividad. Sus unicades son I/(mol · cm)
b: La longitud recorrida por la luz. Se mide en cm.
A: La absorbancia. No tiene unidad.
c: La concentración de la molécula absorbente en la disolución . Se mide en mol/l
Se denomina transmitancia a la relacion entre la intensisdad de la luz incidente y la transmitida T=It/I0. Se expresa en %T = It / Io x 100
La absorbancia representa la medida de la cantidad de radiación absorbida por el analito. Es una medida adimensional y su valor oscila entre 0 e ∞. Normalmente se encuentra entre 0 y 1.
La relación entre la transmitancia y la concentración de una disolución es inversa y logarítmica mientras que la relación entre la absorbancia y la concentración es directamente proporcional*
NO es una cantidad medible, sino que se obtiene por calculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el aparato (espectrofotómetro).
Lambert
Beer
Dice que la cantidad de luz absorbida por una solución es proporcional al espesor e intensidad de color de la solución.
Expresa que la cantidad de radiacion absorbida (A) es proporcional a la absotividad (a) de la muestra y al trayecto optico (b) A = a · b = log 1/T = -log T = log (Io/It)
Aplico estas leyes a disoluciones coloreadas, estableciendo que existe una relación logarítmica entre la intensidad de la luz transmitida y su concentración. A = a · c = log 1/T = -log T = log (I0/It)
Ley de Lambert-Beer dice que la cantidad de sustancia que se encuentra en solución es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
El trayecto óptico (b) esta estandarizado en 1 cm
La absortividad (ε ó a) es una magnitud característica de cada analito Se expresa como:
Absortividad coeficiente de extinción o coeficiente de absorción (a). Obtenemos concentración en g/l
Absortividad molar coeficiente de extincion molar o coeficiente de absorcion molar (ε). Obtenemos concentracion en mol/l
Podemos definir épsilon (ε) como la absorción de una solución de concentración 1 mol/L a una determinada longitud de onda y un espesor de cubeta de 1 cm. Si aumenta épsilon, la absorbancia aumenta.
Podemos realizar la cuantificación del analito por varias formas
Conociendo ε . Este factor no es mas que 1 / ε · b
Mediante una curva de calibración. Con curva de calibración consiste en ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas y determinar su absorbancias, representando gráficamente las concentraciones frente a sus absorbancias.
Por comparación con una solución conocida. Conocemos el valor de la [estándar] (Cs) y determinamos experimentalmente la absorbancia del estándar (As) y del problema (Ap)**.
La linealidad es el intervalo de concentraciones del analito entre los cuales existe una relación directamente proporcional entre concentración y absorbancia.
Los valores de absorbancia están comprendidos entre 0 e ∞
(LL) Limite de linealidad valor max de concentración del analito
(LC) Limite de cuantificación es la menor concentración del analito que es capaz de detectar una técnica o instrumento.
(ICA) Intervalo de concentración aplicable es el comprendido entre (LL) y (LC)