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TÉCNICAS BIOQUÍMICAS (I)
1.2 Espectrofotometría de absorción
1.2.1 Leyes de la absorción
La
ley de Lambert-Beer
relaciona la intensidad de una radiación (Io) que incide en una cubeta con solución coloreada, con la intensidad de la radiación transmitida (It). Matemáticamente se expresa como:
A = ε · b · c
ε:
El coeficiente de exticion molar o coeficiente de absorcion o absortividad. Sus unicades son I/(mol · cm)
b:
La longitud recorrida por la luz. Se mide en cm.
A:
La absorbancia. No tiene unidad.
c:
La concentración de la molécula absorbente en la disolución . Se mide en mol/l
Se denomina
transmitancia
a la relacion entre la intensisdad de la luz incidente y la transmitida
T=It/I0
. Se expresa en
%T = It / Io x 100
La
absorbancia representa la medida de la cantidad de radiación absorbida por el analito
. Es una medida
adimensional
y su valor oscila entre 0 e ∞. Normalmente se encuentra entre 0 y 1.
NO
es una cantidad medible, sino que
se obtiene por calculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el aparato (espectrofotómetro)
.
La relación entre la transmitancia y la concentración de una disolución es inversa y logarítmica mientras que la
relación entre la absorbancia y la concentración es directamente proporcional*
Lambert
Dice que
la cantidad de luz absorbida por una solución es proporcional al espesor e intensidad de color de la solución
.
Expresa que la cantidad de radiacion absorbida (A) es proporcional a la
absotividad (a)
de la muestra y al
trayecto optico (b)
A = a · b = log 1/T = -log T = log (Io/It)
Beer
Aplico estas leyes a disoluciones coloreadas, estableciendo que existe una relación logarítmica entre la intensidad de la luz transmitida y su concentración. A = a · c = log 1/T = -log T = log (I0/It)
Ley de Lambert-Beer
dice que la cantidad de sustancia que se encuentra en solución es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
El trayecto óptico (b)
esta estandarizado en
1 cm
La absortividad (ε ó a)
es una magnitud
característica de cada analito
Se expresa como:
Absortividad
coeficiente de extinción o coeficiente de absorción (a). Obtenemos
concentración en g/l
Absortividad molar
coeficiente de extincion molar o coeficiente de absorcion molar (ε). Obtenemos
concentracion en mol/l
Podemos definir
épsilon (ε)
como la absorción de una solución de concentración 1 mol/L a una determinada longitud de onda y un espesor de cubeta de 1 cm.
Si aumenta épsilon, la absorbancia aumenta
.
Podemos realizar la cuantificación del analito por varias formas
Conociendo ε
. Este factor no es mas que 1 / ε · b
Mediante una curva de calibración
. Con
curva de calibración
consiste en ensayar
varias soluciones de concentraciones conocidas y determinar su absorbancias, representando gráficamente las concentraciones frente a sus absorbancias
.
La
linealidad
es el intervalo de concentraciones del analito entre los cuales existe una relación directamente proporcional entre concentración y absorbancia.
Los valores de absorbancia están comprendidos entre 0 e ∞
(LL) Limite de linealidad
valor max de concentración del analito
(LC) Limite de cuantificación
es la menor concentración del analito que es capaz de detectar una técnica o instrumento.
(ICA) Intervalo de concentración aplicable
es el comprendido entre (LL) y (LC)
Por comparación con una solución conocida
. Conocemos el valor de la [estándar]
(Cs)
y determinamos experimentalmente la absorbancia del estándar
(As) y del problema
(Ap)**.
1.2.2 Componentes basicos
1.2.3 Aspectos prácticos
1.2.4 Análisis de sustancias mediante fotometría de absorción
La
espectrometría de absorción
consiste en la medida de la radiación que llega a un detector tras producirse el fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente.
220 y los 800nm
.
Características
Facilidad determinaciones rápidas
Especificidad relativamente alta
Sensibilidad relativamente alta
Aplicable en autoanalizadores