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Protocolo Western Blotting - Herpes - Coggle Diagram
Protocolo Western Blotting - Herpes
1º - Extração e quantificação das proteínas
Ensaio de Brandford: ELISA e BSA
Sangue e Liquor
Coeficiente de correlação linear deve ser maior que 0,98
Absorbância no comprimento de onda de 595 nm
2º - Fracionamento de proteínas
Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)
As proteínas podem possuir cargas positivas ou negativas,
Tampão SDS/Detergente estabiliza
Visualização
Podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE
Coloração direta do gel, por corantes como o Comassie-Blue
Tratamentos com nitrato de prata.
3º - Transferência para membrana
"Sanduíche"
Membrana
02 filtros de papel molhados com tampão
Gel de Poliacrilamida
"Borrão do gel
02 filtros de papel molhados com tampão
4º - Detecção da proteína específica
Anticorpo reage com o epítopo
1º anticorpo - soro do paciente
2º anticorpo - anti-IgC (Herpes Somplex Vírus 2)
Primário se liga com o secundário permitindo visualização, porém sem fluorescência. Necessário utilização de enzima ou fluoróforo para fluorescência.
5º - Marcação do Anticorpo
A) Conjugação do anticorpo com uma enzima
Como peroxidade ou fosfatase alcalina.
Neste caso, no momento da revelação da membrana, adiciona-se um substrato dessa enzima.
Nos locais onde essa enzima está presente (apenas nos locais onde tem o anticorpo primário,
ou seja, na proteína específica), ocorrerá a reação e a formação do produto dessa reação.
É utilizado um filme, e aparecerá a marcação nas regiões em que ocorreu essa reação,
permitindo localizar a proteína de interesse.
B) Associação do anticorpo com um fluoróforo
Posteriormente excitado com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, e então as regiões onde o anticorpo se ligou serão evidenciadas.