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Molekularbiologische Techniken Block 3 Was habe ich gelernt? - Coggle…
Molekularbiologische Techniken
Block 3 Was habe ich gelernt?
DNA-Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
aus dem Probenmaterial Block 2
Reinheit (purity ratio) zwischen 1.7 und 2.0
Absorptionsmaxiumum
DNA & RNA: 260nm
Proteinen (Histone): 280nm
Messgerät: NanoDrop in Zone 2 (Extraktionsraum)
2 Blindwerte messen und Doppelbestimmung Proben
ACHTUNG!
um RNA oder DNA zu messen sind andere Parametereinstellungen vorhanden
→ siehe Anleitung (dsDNA; 1uL)
RNA-Extraktions aus
PAXgene Blood Röhrchen
Material
Drei Eppendorf-Tubes
letztes wird beschriftet für -20°C-Kühlschrank
(NAME, DATUM, RNA)
1 Shredder-Säule (violett)
1 PAXgene-Säule (pink)
→ Kürzel auf die Deckel
4 Sammelröhrchen (collection tubes) werden verworfen
nicht notwendig zu beschriften
Vorgehen
Lyse
dient dem aktiven Aufbrechen von Zellen aus Gewebe oder Zellkultur, um an Proteine und DNA/RNA im Zellinneren zu gelangen
→ BR1; BR2 ; Proteinase K
Extraktion
auf der Säule wird die DNA immer wieder gewaschen um auf eine hohe Reinheit zu kommen.
→ EtOH, BR3; BR4; BR4
Elution
ausspülen der RNA in ein Eppendorf-Tube
→ BR5
Bei 65°C denaturieren → danach kann gemessen werden oder sonst weiterverwendet (reverse Transkription)
Oder einfrieren bei -20°C bis -80°C. Für die Messung muss es aber wieder auf 65°C temperiert werden
Allgemeines
Eppendorf-Tubes und Pipettenspitzen immer
direkt nach Gebrauch schliessen
Vortexen der Waschlösungen etc. NIE vergessen !
Handschuhe zur rechten Zeit anziehen
Pipetten-Stifte die mit Handschuhen angefasst
werden dürfen verwenden.
Unterschiede von RNA zu DNA-Extraktion
→ siehe Anhang