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基因轉殖及基因剃除技術 - Coggle Diagram

- - - - 目的
        
        使轉殖基因包含可表現基因的所有條件
      - 內容物
        
        啟動子(promoter)
        
        作用
        
        控制基因之表現
        
        編碼區域(coding region)
        
        作用
        
        可經由轉錄和轉譯過程而產生基因產物－蛋白質
    - - 把轉殖基因DNA打入單細胞之受精卵
        
        方式
        
        顯微注射(microinjection)
        
        作用
        
        DNA隨機地插入染色體的任何一個位置
      - 將此受精卵送回至假懷孕之母鼠子宮內
        
        作用
        
        其染色體進行複製而遺傳至小鼠體內的每一個細胞
      - 分離&純化
        
        作用
        
        把轉殖基因DNA片段從質體分離純化出來
      - 基因選殖
        
        目的
        
        得到我們要的轉殖基因株
  - - - 做法
        
        剪一小段約0.5公分之小鼠尾巴
      - 目的
        
        純化出夠做篩選之基因體DNA
    - - 方法
        
        PCR技術
        
        設計一組引子
        
        具可特異地增幅出屬於轉殖基因部分序列的序列
        
        篩選
        
        南方墨點實驗(Southern blot)
        
        篩選
        
        以轉殖基因當作探針
        
        作用
        
        在轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段
        
        計算出有多少套數(copy number)的轉殖基因
        
        發現
        
        1 more item...
  - - - 使用技術
        
        分子生物技術
    - - 使用技術
        
        遺傳工程技術
  - - - 轉殖基因插入染色體之位置
        
        Ex
        
        插入之位置附近有
        
        靜默子(silencer)
        
        促進轉殖基因的表現
        
        加強子(enhancer)
        
        抑制轉殖基因的表現
      - 轉殖基因的套數
        
        太多，會抑制轉殖基因的表現
        
        *轉殖基因DNA片段多是以頭尾相連的多套形式
    - - 異位性表現(ectopic expression)
- - - - 1.5~2.5年
    - - 妊娠時間
        
        19~20天
      - 產數
        
        6~8隻幼鼠
      - 時間
        
        一年四季
    - - 成鼠（6週大）約為30~40克
  - - - 時長-4天
      - 控制因子
        
        促濾泡激素（follicle-stimulating hormone，簡稱FSH）
        
        促黃體激素（luteinizing hormone，簡稱LH）
    - - 改良
        
        控制因子
        
        懷孕母馬血清性腺激素
        （pregnant mare’s serum gonadotropin，簡稱PMSG）
        
        人類絨毛膜性腺激素（human chorionic gonadotropine，簡稱hCG）
        
        效果
        
        時長
        
        4~6週
        
        排卵數
        
        20~30個
        
        目的
        
        減輕收集受精卵和胚胎的工作量
- - - - 方式
        
        電穿孔(electroporation)
    - - 加gancyclovir
        
        針對
        
        有TK的基因序列
        
        名稱
        
        基因剔除(gene knock-out)
        
        原因
        
        造成基因功能破壞之改變
      - 同時加G418和gancyclovir
        *若是使用DT，只加G418即可
      - 加G418
        
        針對
        
        有neo的ES細胞
        
        名稱
        
        基因標的法(gene targeting)
        
        原因
        
        其改變了特定染色體基因
      - 南方墨點實驗
        
        原理
        
        用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。
        
        方式
        
        切割
        
        偵測-探針
      - PCR
        
        方式
        
        引子之設計
        
        一個位於neo內
        
        一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上
        
        結果
        
        做不出PCR產物
        
        非同源重組之ES細胞
        
        可做出PCR產物
        
        同源重組
  - - - ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因(Agouti)
      - 囊胚細胞帶有隱性黑色毛色基因(nonagouti)
    - - 非黑色毛色越多
        
        ES細胞佔嵌合體的比例越大
        
        ES細胞發育成生殖細胞的機率就越大
        
        可將剔除之基因遺傳至後代的機會也就越大。
      - 成果
        
        單套基因剔除小鼠(heterozygous gene knock-out mice)
        
        同型基因剔除小鼠(homozygous gene knock-out mice)
        
        後續作業
        
        相互交配
  - - - 輔助工具
        
        Cre-loxP系統
        
        Cre
        
        身份
        
        P1噬菌體的重組酶(recombinase)
        
        作用
        
        特定地認得loxP序列
        
        若遇是到有兩個loxP是同方向的
        
        Cre會把兩個loxP中間之序列刪除
        
        若遇到兩個loxP是反方向的
        
        Cre會把兩個loxP中間之序列做倒轉
        
        loxP
        
        身份
        
        一組含有34個特定核苷酸之序列
        
        特性
        
        具有方向性
        
        擺放位子
        
        重要外子∕表現序列(exon)的兩旁
        
        Flp-FRT系統
      - 由特定啟動子控制之Cre重組酶的
        基因轉殖小鼠
        
        作用
        
        剃除特定基因
        
        目的
        
        選擇出只在某特定發育時期之啟動子
        
        選擇出只在某特定組織表現之啟動子
      - locP小鼠製作流程
        
        將正向篩選標記放在內子∕插入序列(intron)內
        
        設計標的載體
        
        將兩個同方向之loxP放在標的基因
        之重要外子∕表現序列(exon)的兩旁
        
        結果
        
        留在標的基因內
        
        正向篩選標記
        
        不會留在標的基因內
        
        反向篩選標記
        
        成果
        
        loxP小鼠
      - 互相交配產生同時含有Cre及loxP的小鼠
        
        目的
        
        得到特定發育時期之基因剃除小鼠
        
        得到特定組織之基因剔除小鼠
        
        Cre在特定啟動子的控制下
        
        作用時機
        
        在特定的時間後
        
        在特定的組織後
        
        作用
        
        將兩個loxP中間之序列剔除
- - - - 在體外培養之細胞或是將分子由細胞內抽離出
      - 放入試管內作實驗
    - - 觀察到的結果並不能完全反映真正在動物體內的情形
        -其實驗細胞大多已轉型(transform) 成永生狀態(immortalized)
  - - - 非哺乳類實驗動物
        
        對象：
        
        線蟲(C . elegans)
        
        蟾蜍(Xenopuslaevis)
        
        果蠅(Drosophila melanogaster)
    - - 哺乳類實驗動物
        
        對象：
        
        小鼠（mouse，學名為Mus musculus）
        
        （方式：）
        
        一. 體外培養
        
        胚胎幹細胞
        
        胚胎幹細胞的培養
        （embryonic stemcell，ES 細胞）
        
        將ES 細胞內的遺傳物質做改變
        
        將ES 細胞和胚胎混合
        
        將其放回母體內發育成長
        
        研究動物體內之基因調控
        
        二. 直接操作小鼠胚胎
        
        使用到的技術
        
        基因轉殖(gene transgenic)
        
        基因剔除(gene knock-out)
- - - - 基因殖入(gene knock-in)
        
        對象
        
        基因編碼區域
        
        作用
        
        在某基因之編碼區域內加上外來基因之編碼序列
        
        目的
        
        使外來基因之表現可受此基因之啟動子所調控
      - 點突變
        
        對象
        
        內源基因(endogenous gene)
        
        設置地
        
        位在啟動子區域
        
        結果
        
        研究調控因子對基因表現之重要性
        
        位在編碼區域
        
        結果
        
        研究蛋白質之突變對其功能有何影響。
        
        技術
        
        基因標的法
    - - 二、DNA跳躍子(Transposon)
        
        作用
        
        插入基因體中的任何位置
        
        目的
        
        插在基因體中的任何地方造成基因的破壞
        
        藉由偵測其跳躍子的具體位子以定出問題基因的位置
        
        身份
        
        玉米-跳躍酶(transposase)
        
        作用
        
        對跳躍子兩端的跳躍元素(transposable element)作用，
        讓它在特別的序列中跳進跳出。
        
        類型
        
        睡美人跳躍子（sleeping beauty，簡稱SB）
        
        來源於
        
        鮭魚
        
        作用
        
        條件
        
        跳躍酶
        
        固定插入位置
        
        TA序列
        
        缺點
        
        跳躍頻率仍不太高，不足以進行大規模的篩選突變
        
        PB跳躍子（PiggyBac，簡稱PB）：
        
        來源於
        
        菜蛾
        
        作用
        
        條件
        
        攜帶14 kb的DNA
        
        插入位置
        
        沒有特定的區域，只需要是TTAA序列
        
        優點
        
        在整個基因體中均可以任意跳躍
        
        優點
        
        沒有特定的宿主
      - 一、ENU (n-ethyl-n-nitrosourea)
        
        作用
        
        會對DNA產生破壞，在基因體上會造成隨機的點突變
        
        目的
        
        研究不同突變之成因
        
        輔助工具
        
        依突變表現型(phenotype)進行分類與篩選
        
        身份
        
        突變劑
        
        缺點
        
        需要用到大量的資源及人力
        
        優點
        
        高效率