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Tema 6.2, Centimorgans: 1cM hombres = 1.13Mb (2655cM) 1cM mujeres = 0…
Tema 6.2
Tecnología ADN
recombinante
Aislar gen de un organismo para manipularlo.
Cortar un gen y pegarlo en una posición específica.
Enzimas de
restricción
Mayoría corta secuencias palíndromas dejando puntas pegajosas
Pegar
ADN ligasas
Marcador para detectar la secuencia en las células (ej: color)
Transcriptasa reversa: genera cadena complementaria de ADN para insertarlo en el vector
Aplicaciones: insulina, vacuna HepB, Hormona crecimiento, interferones, antitrombina (Cabras), factor VIII (cerdos), fibrinógeno (conejos), librería cDNA
Ratones
knock out
:one: Insertamos exon (resist antib) a exon
:two: Obtenemos gen que no funciona pero c/resistencia
:three: Células madre de blastocisto de ratón
:four: Metemos nuestro fragmento en célula, por recombinación homóloga se recombinan con nuestro exón y solo crecerán células con la resistencia
:five: Se inyectan células en blastocisto. Obtenemos ratón quimera
:six: Cruzamos quimeras para obtener homocigotos
Vectores
Clonación
Transfieren y replican :warning:fragmentos de ADN
Tipos
Plásmidos: circular en bacterias (0,1-10kb)
Bacteriófago (10-20kb)
Cósmidos: Combina plásmidos y fagos. 35-45kb
Levaduras (YAC): ADN muy grande (100-2000kb) EUCARIOTAS
Expresión
Transfieren ADN para síntesis de :warning:proteínas.
Semejanzas
Marcador de selección (ampicilina)
Origen de replicación
Sitio múltiple de clonación (<> enzimas p/clonar ADN)
Diferencias
Clonación: punto de anclaje sin muchos factores de restricción, marcador de selección de ampicilina, origen de replicación
Expresión (lo de clonación más)
Cola PoliA
Promotor
Señales necesarias para expresar un gen
Mapas
genéticos
Mapa de
ligamiento
Basado en frecuencia de recombinación
Mapa
físico
Basado en la localización física en los cromosomas
Generación
Baja resolución:
hibridación in situ en cromosomas con sondas de reconocimiento de marcadores (todo chr o solo parte), cromosomas de colorines según marcas
Alta resolución:
Faber FISH. Estiramiento de cromatina en única línea de ADN para ver secuencias de genes, inversiones, traslocaciones, etc
Discrepancias
En general, mayor distancia = mayor recombinación
Puntos calientes y fríos (> y < recombinación según correspondería por distancia física)
Sexo progenitor: Mujeres > recombinación (homogaméticos >)
Región cromosómica: Recombinación :heavy_plus_sign: en telómeros que centrómeros :heavy_minus_sign:
Variabilidad innata de cada individuo
Terapia
Génica
Técnicas que consisten en modificar en genes de un individuo para curar enfermedades
Históricamente con vectores virales: adenoasociados (AAV) o lentivirus (inserciones tanto in vivo como ex vivo)
Se aísla virus, se extrae patogenicidad, se inserta ADN de interés, virus se integra en genoma de individuo
CRISPR
Funcionamiento
bacterial
:one: Bacteria corta ADN de virus con Cas9 y lo integra en locus CRISPR
:two: Nueva infección: bacteria produce ARNm con fragmento de ADN vírico
:three: ARNm se une a ARN trac
:four: ARN trac se une a complejo proteico Cas9 y destruyen virus
Particularidad: Cas9 corta un poco más del fragmento identíficado, ese espacio de más se llama PROTOESPACIADOR (NGG)
Terapias
Silenciar
gen
Cas9 corta ADN tóxico, NHEJ lo une pero inactivado
Insertar
gen
Gen se añade a plásmido, Cas9 se usa para cortar ADN y por recombinación homóloga se inserta el gen.
Centimorgans:
1cM hombres = 1.13Mb (2655cM)
1cM mujeres = 0.67Mb (4481cM)
Distancia entre genes = 50 millones pb
Sondas de ADN:
Es un fragmento de ADN de pequeño tamaño usado herramienta para detectar la presencia de secuencias complementarias de ADN
Plásmidos, Bacteriófagos y Cósmidos como huésped para PROCARIOTAS
Levaduras para EUCARIOTAS
Pegar tabla de ventajas y desventajas
In vivo:
Inserto gen con virus
Ex vivo:
Saco células de paciente, las modifico y las inserto de nuevo
Usos:
Duchenne
Anemia falciforme (corrección gen globina)
Cáncer