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Trasferimento genico orizzontale (Coniugazione (Hfr (Scoperta (Esperimento…
Trasferimento genico orizzontale
Coniugazione
Contatto diretto tra 2 cellule
Complesso multiproteico, apparato di coniugazione
Scoperta
Lederberg e Tatum
Ceppo A prototrofo per alcuni amminoacidi, auxotrofo per altri
Ceppo B con necessità metaboliche "complementari" al ceppo A
Su terreno minimo nessuno dei due cresce
Se mischio i ceppi, li lascio in incubazione e piastro su terreno minimo compaiono ricombinanti capaci di sintetizzare tutto da soli
E' improbabile che sia una retromutazione
Davis
Esperimento che prova che coniugazione non è risultato di fattori diffusibili, serve contatto
Tubo a U con setto poroso a metà che lascia passare terreno ma non batteri, non ho ricombinanti
Coppie
Polarità opposta
Donatori F+, riceventi F-
Fattore F trasmissibile
In presenza di antibiotico, ricombinazione si osserva solo se il ricevente è resistente
Meccanismo
Plasmide F
Regione tra
25 geni formazione del pilo e contatto coniugativo
Sito oriT
Taglio del filamento
Trasferimento DNA
Singolo filamento
Leading region codifica per proteine SSB che proteggono da nucleasi
Geni mob
2 regioni
nic
Sito in oriT dove avviene il taglio
regione che esprime la proteina (nickasi) che effettua il taglio
Tappe
Contatto
Punta del pilo F e recettore sul ricevente
Depolimerizzazione pilina, pilo si accorcia e avvicina membrane fino a formare un poro
Contatto tra due F+ raro grazie a esclusione di superficie che non fa stabilizzare legame tra due cellule con plasmidi simili
Mobilizzazione DNA
Rilassosoma
Incide un'elica al sito nic rilassando il superavvolgimento
Si associa al poro e "spinge" lo strand attraverso di esso
Rilassasi/elicasi ATPasiche
Replicazione
Filamento intatto stampo nella donatrice usando la sua DNApol III :
Cerchio rotante
Filamento T legato alla rilassasi spinto nel ricevente e convertito in dsDNA
Destabilizzazione e separazione
Hfr
Batteri F+ in cui plasmide F si integra nel cromosoma per ricombinazione omologa tra sequenze IS
Possono promuovere trasferimento cromosoma batterico
Escissione può avvenire in modo impreciso, plasmide si porta alcuni geni; se coniugazione, nel ricevente si formano diploidi parziali
Coniugazione tra
Hfr e F-
Fattore F tagliato da enzima, crea origine trasferimento
Trasferimento del cromosoma + replicazione
Fattore F è alla fine (dall'altro lato dell'origine), trasferimento si interrompe prima
Geni trasferiti possono ricombinare. Si ottengono una Hfr e una F-
F' e F-
F' è cellula in cui escissione imprecisa di F, plasmide + porzione di cromosoma batterico
Coniugazione, cellula F- ricevente diventa parzialmente diploide per i geni ricevuti, merozigote
Scoperta
Ceppi Hfr isolati casualmente da Cavalli-Sforza e Hayes
Varianti spontanee di F+
Esperimento dell'incrocio interrotto
Incrocio
Ceppo F- SmR, aziS, tonS, lac- e gal -
Ceppo F+ SmS, aziR, tonR, lac+ e gal+
Si osservano ricombinanti
Frequenza di ricombinazione diminuisce con distanza
Mappa circolare
Distanza in minuti
Trasferimento lineare del genoma
Trasformazione
DNA nell'ambiente viene acquisito stabilmente nel batterio
DNA trasformante può derivare da lisi batterica
Competenza
Capacità dei batteri di acquisire DNA esogeno
Sviluppo della competenza
Gram +
Fattore di competenza colpisce recettore sulla superficie
Cellula sintetizza autolisina
Autolisina fa esporre sulla superficie batterica proteine leganti il DNA e nucleasi
dsDNA si lega reversibilmente a recettori su membrana
Legame diventa irreversibile
Endonucleasi frammenta, esonucleasi degrada uno dei due filamenti
Proteine SSB traslocano ssDNA dentro, ssDNA si associa a RecA e può ricombinare
Gram -
DNA deve contenere sequenze DUS riconosciute
Vescicole di membrana, trasformosomi
Recettore riconosce DNA, vescicole catturano dsDNA
Ricombinazione omologa
Significato biologico
No competenza = meccanismo di difesa del genoma
Vantaggio biologico: aumentare variabilità genetica
Artificiale
Shock termico o elettroporatore
Permeabilizza la membrana
Serve DNA a doppia elica
Scoperta
Griffith e Avery 1920
Streptococcus pneumoniae
Ceppi wt: hanno capsula, colonie lisce S, infettivi, uccidono topi
Mutanti: no capsula, colonie rugose R, non infettivi, non uccidono i topi
Si iniettano ceppo S vivo e inattivato al calore e ceppo R, risultati prevedibili
Se inietto ceppo S ucciso al calore + ceppo R vivo, topo muore e si trovano nel cuore cellule S vive: trasformazione da R a S
Principio trasformante
Avery, Mac Leod e McCarty 1944
Batteri S vivi
Lisato cellulare
Trattamento con enzimi
DNAsi, RNAsi, glicosilasi, proteasi. Degradano diverse molecole
Aggiunta batteri R vivi e piastramento
Trasformazione non avviene dove ho messo DNAsi, DNA è principio trasformante
Piastramento
Nessuna colonia
Aggiunta batteri R vivi e piastramento: colonie S e colonie R
Altro esperimento
"Principio trasformante"
Lisato di batteri S
Separato nelle componenti proteiche, glucidiche, nucleiche...
Topo muore solo iniettando componente di acidi nucleici; se aggiungo nucleasi vive
Conferma che il DNA è il materiale genetico
Confermato da Hershey e Chase 1952
Batteriofago T2, ciclo litico
Fagi cresciuti in 35S
Incorporato nelle proteine
Radioattività nel liquido (capsidi fagici)
Infezione fagica si interrompe con frullatore, miscela centrifugata: batteri sedimentano sul fondo. Si misura radioattività nel sedimento e nel supernatante
Fagi cresciuti in 32P
Incorporato nel DNA
Radioattività nel sedimento (nei batteri)
Conferma che DNA è materiale genetico
Trasduzione
Scoperta
Lederberg e Zinder 1952
Tubo a U con setto mediano che trattiene cellule
Due ceppi nei due lati del tubo a U, auxotrofi per alcuni amminoacidi e prototrofi per altri
Uno dei due ceppi piastrato su terreno minimo origina colonie prototrofe
Salmonella typhimurium
Trasferimento senza contatto fisico e insensibile alle DNAsi
2 tipi
Generalizzata
Qualsiasi marcatore genico si può trasferire
Meccanismo
Fago inietta DNA nell'ospite, replicazione del fago
Si può creare fago trasducente che incorpora per sbaglio DNA ospite
Fago trasducente inietta DNA donatore nell'ospite, ricombinazione
Fagi per trasduzione generalizzata devono avere meccanismo di impacchettamento che permette riconoscimento accidentale DNA ospite
Fago trasducente è difettivo, non ha DNA virale, non inizia ciclo litico
Quantità DNA trasportata dipende da dimensioni capside
Molto del DNA trasdotto non si integra ma si può esprimere per poche generazioni come diploidi parziali (trasduzione abortiva)
Qualsiasi frammento cromosoma può essere trasdotto
Destino DNA batterico
Formazione di transduttanti stabili, 10% del DNA cromosomico dei fagi ricombina
Trasduttanti abortivi, DNA batterico non ricombina con cromosoma, non si replica e viene "diluito" con la crescita
Esperimento Ebel-Tipsis
Crescita batteri in terreno con 15N e 2H, DNA più pesante
Trasferimento in terreno "leggero" e infezione con fago P22
Fago prodotto avrà DNA fagico leggero e DNA trasducente più denso
Centrifugazione particelle virali in CsCl alla fine del ciclo litico
Fagi trasducenti contengono DNA "pesante", sedimentano a densità più elevata
Fagi trasducenti isolati e usati per infettare batteri "leggeri"
Dopo un po' si estrae e frammenta il DNA batterico e si centrifuga in gradiente CsCl. Si ottiene picco di DNA a densità normale e picco (più piccolo) a densità elevata
Specializzata
Marcatori specifici vengono trasferiti
Geni trasdotti legati covalentemente al DNA fagico, non lo sostituiscono
Meccanismo
Cromosoma batterico con profago
Induzione ciclo litico, profago escisso in modo non corretto, DNA fagico incorpora geni batterici
Fago infetta nuovo ospite, DNA fagico incorporato nel cromosoma insieme a geni ospite precedente
Batteriofagi temperati
Lisogenia
Ciclo
Infezione batteriofago, circolarizzazione DNA fagico
Scelta tra litico e lisogeno
Litico: sintesi di proteine per replicazione, replicazione, sintesi di proteine virioni, impacchettamento, lisi
Lisogeno: DNA virale si integra nel cromosoma batterico, immunità; Divisione cellulare, popolazione di batteri lisogeni; avvio del ciclo litico spontaneo o indotto
Differenze con generalizzata
Solo geni vicini a sito di inserzione possono trasdurre
Particelle trasducenti contengono sia DNA batterico che fagico