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Tecniche per lo studio dei virus (Identificazione virus in un campione…
Tecniche per lo studio dei virus
Coltivazione
Necessaria per aumentare numero di virus e studiarli
Serve per osservare effetti su cellule o organismi
Colture cellulari o colture d'organo
Svantaggi
A volte virus non crescono, bisogna indurli
Colture cellulari non riflettono bene cellule infettate in natura
Pressione selettiva differente sul virus nella coltura rispetto a quello originale
Effetto citopatico= morte cellule in coltura, segno di successo colturale dei virus
Quantificazione
Titolo virale
Esprime concentrazione virus
Unità virali/ml di campione
2 misure
Titolo delle particelle fisiche
Emoagglutinazione
Avviene grazie a proteine su superficie virus
Avviene anche se virus non è infettivo
Diluizioni seriali, piastra 96 pozzetti, più alta diluizione ancora in grado di indurre emagglutinazione viene definita 1 unità HA (emagglutinante). Si quantifica HA/ml
Titolo delle particelle infettive
Saggio delle placche
Applicabile solo in caso di virus in cui c'è effetto citopatico
Diluizioni seriali virus
Inoculo quantità nota di ogni diluizione su monostrato cellulare
A diluizioni alte (concentrazioni basse) cellule infettate sono abbastanza lontane. Si usa agar per solidificare tutto e limitare diffusione virus; si osservano placche derivanti da singole unità formanti placche, si calcola numero di pfu/ml
Saggio dose infettiva tissutale 50%
Sempre basato su effetto citopatico
Come placche ma si fa in piastra 96 pozzetti
Dopo 3 cicli di infezione si fissa e si colora e si determina diluizione che produce effetto citopatico nel 50% della coltura
Saggio dei foci fluorescenti
Come saggio delle placche ma si fissano le cellule nel primo ciclo, poi si aggiunge anticorpo primario che lega proteine virali, anticorpo fluorescente che lega anticorpo primario e si valuta fluorescenza nelle cellule
Rapporto titolo fisico/titolo infettivo alto
2 motivi
Inefficienza test infettività, non tutte le particelle capaci di infezione ci riescono
Alcune particelle sono difettive a causa dell'alto tasso di replicazione
Identificazione virus in un campione
Test usano anticorpi che riconoscono antigeni virali
Anticorpi si trovano nel siero, componente liquida sangue che rimane dopo coagulazione
Siero che contiene anticorpi reattivi = antisiero
ELISA
Anticorpi specifici (A) per antigene legati a pozzetto piastra
Si versa campione e si lava, eventuali antigeni restano attaccati ad anticorpi
Si aggiunge altro anticorpo (B) che si lega all'antigene, prodotto in specie animale diversa
Anticorpo C coniugato ad enzima si lega ad anticorpo B
Si aggiunge substrato cromogeno dell'enzima e si analizza in spettrofotometria
Saggio PCR
Si usano primer che identificano regioni ben conservate del genoma virale
Dopo 30 cicli, se campione conteneva sequenza di legame dei primer, si ottiene prodotto visibile
Saggio bDNA
Branched DNA
Simile a ELISA
Si legano oligonucleotidi specifici su pozzetti, poi si lega campione, poi rete di appaiamenti e alla fine enzima con substrato cromogenico
Determinazione di anticorpi virus specifici
Tecnica ELISA per cattura di anticorpi
Antigene immobilizzato nel pozzetto, si inoculano campioni di siero da analizzare per la presenza di anticorpi da testare
Test di neutralizzazione
Identifica sierotipo del virus
Aggiungo a virus il siero (estratto dal sangue) e vedo se perde o no l'infettività: se la perde, è stato neutralizzato da anticorpo nel siero quindi ho avuto quel sierotipo di virus