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Genomica microbica (Dimensioni del genoma (Contenuto (Geni metabolici sono…

- - - - 500 geni
      - Stima: 200-300 geni essenziali per la vita
- - - - Dipendono da cellule organismo
      - Genoma più piccolo di quello di un organello
      - Forniscono vitamine, cofattori, amminoacidi
      - Poche evidenze su trasferimento genico da simbionte a cellula
      - Proteine cellula non entrano nel simbionte
- - - - Paraloghi
        
        Derivano da duplicazione
        
        es. geni per le varianti (isoenzimi) della lattato deidrogenasi (LDH) umana
      - Ortologhi
        
        Derivano da antenato comune
        
        es. gene per LDH Lactobacillus è ortologo di geni LDH umani
  - - - Geni che codificano proteine tipiche di specie poco correlate
      - Sequenze con percentuali GC o codon bias (schema di uso dei codoni sinonimi) diverse da resto del genoma
    - - Geni metabolici
      - Geni di virulenza
  - - - Ce ne sono pochi in batteri con nicchie ecologiche stabili
      - Grandi quantità in batteri a rapida evoluzione
      - Elementi trasponibili i cui geni codificano solo trasposizione
      - Hanno contribuito all'evoluzione di batteri patogeni e a formazione di plasmidi
- - - - NAP
        
        Nucleoid- associated proteins
        
        Ruolo analogo agli istoni, non omologhe ad essi
        
        Condensazione cromosoma, ciclo cellulare
        
        Abbondanza relativa varia con fasi di crescita
        
        In fase stazionaria nucleoide più compatto
      - MukB
        
        SMC-like protein
        
        SMC: Structural Maintenance of Chromosome, eucariotiche
        
        2 teste globulari N e C terminali con domini ATP asici
        
        2 regioni coiled coil intermedie unite da terzo dominio globulare
        
        Nei procarioti: omodimero
        
        Configurazioni
        
        Aperta
        
        "Forbice" che si muove sul DNA con le "teste"
        
        Chiusa
        
        Cambiamento conformazionale condensa il DNA
      - Forze entropiche (presenza di molte molecole nella cellula)
      - Topologia
        
        DNA girasi
        
        Topoisomerasi II
        
        Tetramero
        
        2 subunità GyrA catalizzano rottura e riunione DNA
        
        2 subunità GyrB legano e idrolizzano ATP
        
        Antibiotici bloccano GyrA o GyrB
        
        Domini topologicamente indipendenti legati alla membrana
        
        Superavvolgimento di uno non influenza altro. Confini variabili con fasi del ciclo cellulare
        
        Sequenze tenute in determinati punti es. ori e ter orientate verso i poli. Orientamento cambia nel ciclo cellulare
    - - In crescita rapida: più copie cromosomiche
      - Sia Bacteria che Archaea
    - - Due metà cromosoma batterico, separate da OriC
      - Filamento leading e lagging
      - Più geni su leading
        
        Replicazione e trascrizione associate
        
        Si scontrano se vanno in direzioni opposte
        
        Se replicazione e trascrizione vanno nello stesso senso (leading) nessun problema
        
        Corrispondenza tra filamento leading e codificante
      - Macrodomini funzionali
        
        Gruppi di geni regolati in base a posizione e orientamento
      - Vicino a origine: più copie geni, più espressi
    - - Regioni che sembrano provenire da altri batteri
      - Isole di fitness
        
        Isole genomiche selezionate positivamente
        
        Sottotipi
        
        Isole ecologiche, resistenza antibiotici
        
        Isole saprofitismo, cattura del rame
        
        Isole di simbiosi, fissazione dell'azoto
        
        Isole di patogenicità
        
        Fattori di virulenza, tossine, proteine per adesione ospite
        
        Presenti anche su plasmidi, trasposoni, batteriofagi...
  - - - Replicano autonomamente
      - Presenti in molti organismi
      - Numero di copie variabile
      - Potere codificante
        
        Numero di geni
        
        Variabile
      - Caratteri fenotipici aggiuntivi
      - Doppio filamento
        
        Circolare
        
        Lineare
        
        Telomeri con proteina terminale al 5' o estremità 3' e 5' legate covalentemente tra loro
      - 2 tipi di informazione
        
        Relativa a replicazione
        
        Costante per famiglie di plasmidi
        
        Replicone
        
        Caratteristiche accessorie
        
        Variano molto frequentemente
      - Replicazione
        
        Autonoma
        
        Indipendente da quella del cromosoma
        
        Usano comunque strutture della cellula
        
        Repliconi
        
        Capaci di replicazione autonoma
        
        Origine di replicazione OriV
        
        Oltre a replicazione controlla:
        
        Numero di copie
        
        Specificità d'ospite
        
        Gruppi di incompatibilità
        
        Ripartizione
        
        Incompatibilità
        
        Compatibili
        
        Plasmidi con diversi meccanismi di controllo, ripartiti indipendentemente tra cellule figlie che li mantengono entrambi
        
        Incompatibili
        
        Identici per il "core" di replicazione, riconosciuti come stesso tipo di plasmide, controllano uno la replicazione dell'altro
        
        Gruppi di incompatibilità
        
        A volte, plasmidi compatibili si escludono a vicenda: esclusione plasmidica
        
        Due popolazioni con due plasmidi separati
        
        Incapacità di due plasmidi con sistemi di replicazione simile di coesistere nella stessa cellula
        
        Basata su meccanismi per il controllo del numero di copie
        
        Due plasmidi in una cellula competono per raggiungimento numero di copie prefissato, si creano cellule solo con uno e cellule solo con l'altro
        
        Spettro d'ospite
        
        Ampio
        
        Ristretto
        
        Basso numero copie
        
        Sistema par
        
        Plasmide R1
        
        3 componenti
        
        ParM (ATPasi motrice)
        
        ParR legante il centromero e ParM
        
        Centromero ParC
        
        ParM polimerizza idrolizzando ATP, spinge plasmidi ai poli
        
        Idrolisi ATP permette distacco ParM da ParR, nuovi ParM-ATP entrano e filamento si allunga
        
        Tossine uccidono chi non eredita plasmide (plasmide F ed R)
        
        Alto numero di copie
        
        Ripartizione stocastica o casuale
        
        Rip. attiva
        
        Plasmidi riconosciuti da proteina
        
        Proteina dimerizza formando coppie di plasmidi
        
        Struttura DNA-dimero-DNA si mette sul sito di divisione
        
        Modelli
        
        Theta
        
        Unidirezionale
        
        Filamento a sintesi continua non ha problemi, filamento lagging richiede un primosoma
        
        Bidirezionale
        
        Due filamenti richiedono due complessi elicasi primasi
        
        Circolo rotante
        
        Taglio in una delle due eliche, legame proteine SSB
        
        DNA intatto circolare fa da stampo per filamento leading
        
        Estremità 5' filamento tagliato si srotola man mano
        
        Sul filamento tagliato sintesi 5'-3' filamento lagging
        
        Plasmidi lineari
        
        Meno diffusa
        
        Richiede protelomerasi per impedire circolarizzazione
        
        Controllo
        
        In base a replicazione cromosoma
        
        Rilassato
        
        Replicazione indipendente da cromosoma
        
        Molte copie per batterio
        
        Stringente
        
        Poche copie per batterio
        
        Replicazione coordinata con cromosoma
        
        Se ci sono deviazioni dal numero di copie medio: controllo negativo, concentrazione di inibitore che agisce in trans
        
        Controllo numero di copie
        
        ColE1
        
        Replicazione dipende da sintesi RNAII, un primer codificato da regione a monte di OriV
        
        RNAsiH riconosce ibrido DNA-RNA e taglia RNAII generando estremo 3'OH per DNA pol I
        
        Se RNAII viene riconosciuto da RNAI, ibrido RNA-RNA, non si appaia a OriV e non viene riconosciuto da RNAsi H
        
        Proteina Rop favorisce legame RNA-RNA. Livelli di Rop e RNAI aumentano all'aumentare del numero di copie del plasmide: feedback negativo
        
        Plasmide R
        
        Proteina RepA si lega a oriR1 e fa partire replicazione, gene repA a monte dell'origine
        
        CopB repressore di RepA quando viene trascritto assieme a RepA dal promotore P1, reprime trascrizione da P2
        
        CopA è mRNA che inibisce mRNA di repA, trascritto da destra a sinistra. E' instabile e si degrada velocemente, funziona solo se ho tante copie plasmide
        
        Ordine: P1-CopB-P2-RepA-OriR1
      - Metodi per lo studio
        
        Estrazione DNA
        
        Ultracentrifugazione in gradiente di CsCl con etidio bromuro: cromosoma (grande) si frammenta e linearizza, intercala molto bromuro di et. e si abbassa densità. Plasmide non frammenta, resta piccolo e circolare, non intercala br di et, resta denso
        
        Corsa elettroforetica, plasmide corre di più (meno ingombro)
      - Tipi di plasmide
        
        Coniugativi
        
        Contengono geni per i pili
        
        Trasferibili per coniugazione
        
        Possono integrarsi nel cromosoma
        
        Plasmide F
        
        Grandi dimensioni, basso numero di copie
        
        Regione tra permette coniugazione
        
        Replicazione theta e cerchio rotante
        
        Replicazione sincronizzata con cromosoma, è in rapporto stechiometrico con esso
        
        Plasmide di fertilità, permette formazione dei pili
        
        Sistema tossina/antitossina #
        
        Elimina cellule che non hanno ricevuto almeno una copia
        
        CcdB tossina che inibisce girasi, stabile; CcdA antitossina instabile
        
        Serve plasmide per sintetizzare costantemente CcdA altrimenti si degrada prima di CcdB e cellula muore
        
        Codifica per RepE coinvolta nella sua replicazione
        
        R
        
        Plasmide R1
        
        Geni resistenza antibiotici
        
        Altro modello, simile a F
        
        Codifica per resistenze
        
        Sistema hok-sok #
        
        Elimina cellule che non ricevono almeno una copia
        
        Gene letale hok, mRNA emivita 20min
        
        mRNA sok inibisce hok, emivita 1 min
        
        Solo cellula che sintetizza costantemente sok vive
        
        Col
        
        Geni per batteriocine che uccidono altri batteri
        
        Plasmide ColE1
        
        Altro modello insieme a F
        
        Codifica per batteriocina colicina E1
        
        Conferisce immunità a colicinaE1
        
        Di virulenza
        
        Geni per fattori di virulenza (tossine o invasine)
    - - IS
        
        Insertion sequences
        
        Codificano per le sequenze che li traspongono
        
        Causano mutazioni
        
        Struttura: regione per le trasposasi fiancheggiata da sequenze inverted repeat IR (siti di riconoscimento)
        
        Fuori da IS: DR, direct repeat, breve ripetizione di sequenza in cui IS è inserita
      - Trasposoni
        
        Anche funzioni accessorie
        
        es. resistenza ad antibiotici: Tn1 codifica per beta lattamadi, resistenza ad antibiotici beta lattamici
        
        2 modelli
        
        Trasposoni compositi
        
        "Modulari", hanno modulo centrale per funzioni accessorie + IS laterale
        
        Origine: IS trasposta in un sito adiacente e mutazione che inattiva la trasposasi di uno dei due, il sistema si muove tutto insieme
        
        Trasposoni semplici
        
        Simili a IS con funzioni accessorie
        
        2 meccanismi trasposizione
        
        Conservativa o semplice
        
        "Taglia e incolla": escissione e reinserzione precisa
        
        Trasposasi induce tagli sfalsati generando OH liberi che vengono poi completati
        
        Replicativa
        
        Replicazione del trasposone contemporanea a traslocazione della copia
        
        Regolazione frequenza trasposizione
        
        Modello Tn10
        
        Sequenza: IS10L, Tc, IS10R, promotore Pout e promotore Pin
        
        Pout trascrizione fuori, Pin trascrive IS10R = trasposasi
        
        Traduzione mRNA "in" è inibita da mRNA "out"
        
        Copie multiple di trasposone non hanno frequenza maggiore di trasposizione perché 1) la trasposasi è instabile non si accumula e 2)trascritto di Pout vive più di trasposasi e può inibire espressione di trasposasi in tutte le copie di Tn10
        
        Trasposizione connessa a replicazione
        
        Metilazione filamenti neosintetizzati dopo replicazione impiega 1-2min
        
        Sito metilazione su Pin, se è emimetilato lega polimerasi con maggiore efficienza
      - Batteriofagi trasponibili
        
        Lisogenia
        
        Batteriofagi temperati
        
        Batteri lisogeni
        
        Profago
        
        Conferisce immunità a fagi dello stesso tipo e spegne via litica
- - - - Studiati con mutazioni knockout in lievito diploide e aploide
      - 900ORF essenziali