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EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (SOLUÇÕES (Inibidores de nucleases (EDTA,…
EXTRAÇÃO DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
DNA
boa qualidade
boa quantidade
pureza
integridade
ETAPAS
(I)
LISE
(rompimento de membranas)
Liberação dos componentes citoplasmáticos
Métodos
mecânicos
sonificação
físicos
quebra mecânica da célula
químicos
enzimas
Lisozimas
Proteinase K
rompe cadeias polipeptídicas
inativa
nucleases
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EDTA
age na parede de bactérias G-
proteção do DNA
remoção de íons bivalentes
ação
quelante
(no tampão)
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detergentes
SDS
(mais forte)
dissocia
proteínas dos ácidos nucleicos
dissolve
proteínas de membrana
Saponina
Triton X-100
(mais fraco)
mantém proteínas de membrana
(II)
PURIFICAÇÃO DA AMOSTRA
mistura de macromoléculas complexas
Liberação
do ácido nucleico
Isolamento
do ácido nucleico
Separação
(DNA/RNA/Proteínas)
Centrifugação
do Lisado
03 fases
aquosa
interface proteica
fenol
solventes
precipitam proteínas e restos celulares
fenol
desnaturação proteica
sais
solventes orgânicos
(III)
EXTRAÇÃO
DNA
fenol
pH
básico
(8,0)
camada aquosa composta de àcidos nucleicos
RNA sofre
hidrólise
em pH básico
RNA
fenol
pH
ácido
(4,0)
camada aquosa composta de RNA
(IV)
PRECIPITAÇÃO
+ lavagem com àlcool
etanol 70%
remoção de sais
etanol absoluto
DNA
isopropanol
RNA
SOLUÇÕES
Inibidores de nucleases
EDTA
DEPC
Tampão de Extração
pH ideal
Solução de lise
Solução desnaturante de proteínas
Fenol
remoção da contaminação com proteínas
Clorofórmio
desnaturação proteica
Etanol
alterações estruturais na molécula de ácido nucleico
precipitação
Proteinase K
desnaturação proteica
isolar DNA/RNA
Detergentes
