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TESTES SOROLÓGICOS NÃO MARCADOS (Precipitação (Imunodifusão (Imunodifusão…
TESTES SOROLÓGICOS NÃO MARCADOS
Detectam/quantificam as consequências da ligação Ag-Ac
Precipitação
Baixa sensibilidade de detecção, precisa de grandes complexos de ag-ac para detectar
Depende das concentrações de Ag-Ac, precisam ser equivalentes para a precipitação ser máxima.
Fenômeno de Prozona
: excesso de Ac que podem causar erros na interpretação, necessário realizar titulação para evitar erros.
Precipitados já formados podem se dissolver na presença de um dos reagentes por causa da ligação Ag-Ac.
Precipitam na presença de Ac, proteínas, carboidratos e complexos glicolipídicos.
Utilizado para detectar os Ac produzidos contra Ag
sólúveis!
Ag e Ac são solúveis
Técnicas manuais:meio gelificado: facilita leitura e reduz volumes necessários para interação. *Desvantag: período de horas ou dias par o resultado
Imunodifusão
Difusão do Ag e Ac solúveis em meio fluido/gelificado (ágar ou gel de agarose). Resultado do movimento molecular ao acaso. Detecta a reação de Ag-Ac por formação de um precipitado.
Substância é transportada de uma parte para outra.
Simples:
Ag/Ac fixado ao suporte e o outro se difunde, até haver a precipitação do complexo.
Dupla:
Ag/Ac se movem, um em direção ao outro, até haver a precipitação.
Em ambos os casos, a difusão pode ser
Linear:
unidimensional;
Radial:
bidimensional
Imunodifusão Simples Linear
Difusão simples em tubo
Ocorre a mobilização de um dos componentes (Ag ou Ac) no meio gel.
Após a gelificação, adiciona-se outro componente e aguarda a formação da linha de precipitação na zona de equivalência.
A concentração do reagente externo deve ser maior do que a concentração contida no gel.
Pesquisa de crioglobulina em pacientes com hepatite C.
Análise quantitativa e qualitativa
Imunodifusão Simples Radial
Princípio: permite a quantificação de Ag e Ac.
Técnica: Agar é misturado com a diluição apropriada de Ac específico para determinado Ag; Essa mistura é colocada em uma placa de Petri ou em lâmina; Em locais apropriados do gel, são feitos orifícios; Colocam volumes precisos das soluções de Ag e solução-padrão (pelo menos três concentrações conhecidas de Ag); Incubação: 48-72h ou até o término da difusão;
O diâmetro do halo/anel é proporcional a concentração do Ag.
Construção da curva padrão permite determinar a concentração do Ag.
Quantificação de imunoglobulinas séricas, transferrina, proteína-C-reativa, componentes do complemento.
Imunodifusão Dupla
Princípio: nesta técnica os dois componentes, Ag e Ac, difundem-se radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio gelificado, e se encontram formando linhas ou arco de precipitação.
Radial
Desvantagem: lenta (18-24hrs de difusão) e baixa sensibilidade.
Técnica: Camada de ágar em lâmina de vidro ou placa de Petri; Após gelificação, são feitos orifícios no ágar; As soluções contendo Ag e Ac são colocados nos orifícios do ágar; Incubação: 18-48h/37oC ou 2-3 dias a temperatura ambiente. Coloca-se agarose sobre uma lâmina. Faz-se em seguida,pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções teste de Ag e Ac.
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e Ac se encontrarem em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha precipitada.
Precipitação que ocorre na região de equivalência, perpendicular à linha do eixo entre dois orifícios.
Linha de precipitação: corresponde a uma par de Ag-Ac.
Doenças auto-imunes: artrite reumatoide, lúpus eritematoso, esclerose sistêmica.
Aglutinação
Aglutinação direta
Formação de agregados visíveis
Interação de Ag particulado (insolúvel - Hm, bactérias, fungos e protoz.) com Ac específico
Vantagens:
elevada sensibilidade, menor custo, facilidade e rapidez.
Desvantagem:
reprodutibilidade e estabilidade do complexo formado.
Concentrações de Ag e Ac fora da zona de equivalência podem gerar resultado falso-negativo.
Proporção deve ser igual
Uso:
diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos; tipagem sanguínea ABO e Rh.
Realizado em tudo ou lâmina
Aglutinação indireta
Teste de Aglutinação do Látex
FATOR REUMATOIDE
(FR): Ac da classe IgM dirigido contra a IgG (porção Fc do anticorpo IgG). Adsorvendo IgG passivamente às partículas de látex, haverá a exposição dos determinantes de IgG que reagem com o fator reumatoide, resultando em aglutinação.
*O fator reumatoide e a IgG se unem para formar complexos imunes que contribuem para causar doenças reumatológicas.
Partículas de látex (esferas de poliestireno) são usadas como suporte na adsorção de proteína solúvel e Ag polissac. -> sistema indicador da reação Ag-Ac.
O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. Exemplo: na detecção de anticorpos
antiestreptolisina O.
Pesquisa de
proteína C
Aglutinação Reversa
faz o teste com suporte revestido com Anticorpo (detecção da proteína C reativa)
Hemaglutinação passiva
Ex: Doença de Chagas
Ac do soro -> Ag solúvel adsorvido ao suporte (Hm) -> aglutinação
Hemácias de carneiro ou humanos do grupo O, pois são de fácil obtenção.
Série de antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos.
Formação de agregados por
adsorção
visíveis entre uma partícula inerte (suporte) recoberta de Ag solúvel e seu Ac específico.
Lâmina ou microplaca em “U” ou “V”
Uso:
diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatoide, ASO (antiestreptolisina O) e etc.
Variante:
Microfloculação
Interação de Ac específico com Ag, formando imunocomplexos em meio líquido, detectáveis com lupa ou microscópio.
teste
VDRL
: cristais de colesterol que são sensibilizados com cardiolipina p pesquisa de Ac na Sífilis.
Detecta Ac antilipídicos (resposta imunológica ao material lipidico) - cel lesadas e material do próprio treponema.
Suporte: Cristais de colesterol; Ag: Cardiolipina; Placas escavadas; Pesquisa de Reaginas.
Inibição de Hemaglutinação
Direta
Capacidade que certos Ag virais tem de aglutinar certas Hm, espontaneamente
Ac presentes na amostra, inibem a aglutinação das Hm. -> Teste positivo para presença de Ac.
Ex: Detectar Ac contra virus da
Sarampo, rubéola,
etc
Técnica: pega o soro do pct (contem Ac ou não) e coloca na presença de Ag (hemaglutina). Dps, adição da suspensão de Hm. (+): ausencia de aglutinação
Indireta
Sensível e específico na detecção de pequenas quant. de Ag solúveis, haptenos ou anticorpos que competem com as substância homologa com que a particula foi sensibilizada.
Baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do Ac, entre o Ag fixado à partícula e o Ag solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quant. do Ag presente na amostra e, tb com a afinidade pelos sítios de combinação do Ac.
Ex:
Presença de hCG na urina.
Urina + soro anti-hCG -> são incubados e colocados numa placo. + partículas revestidas com hCG. (+): tem hcg, não aglutina. (Ac se ligaram aos Ag hcg da urina) . (-): ausencia de hcg, aglutina. Ac iniciais ficam livres e se aglutinam nas part revestidas.
aglutinação com látex
Ensaios Líticos
Reação de fixação do complemento
A ligação do Ac-Ag promove a fixação do complemento, cujo consumo, in vitro, serve para detectar a presença de Ac e Ag. -> detecção a partir do produto final: hemólise
Etapas
1°
: interação antígeno-anticorpo na presença de complemento -> Ag-Ac é incubado + qnt definida de complemento
2°
: adição do sistema indicador -> adição de hemácias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo anti-hemácia de carneiro -> obtidos a partir de coelhos).
Usp: *Doença de Chagas, neurocisticercose, sífilis
No caso de haver Ac pesquisado na amostra: ocorrerá a formação do imunocomplexo (Ag-Ac) que por sua vez será fixado ao sistema complemento. Assim, não haverá sistema complemento livre para ação lítica sobre o sistema indicador. Portanto, ausência de hemólise no final da reação indica que havia Ac, IgG /ou IgM, na amostra (testes positivo).