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IMPORT RE (Folding delle catene (la catena polipeptidica può trovarsi o in…

- - - - La catena polipeptidica glicosilata subisce delle modficazioni: La prima cosa che accade è che vengono staccati, da parte della glucosilasi I e II, il terzo e il secondo glucosio. In questo modo resta una catena polipeptidica che espone sulla ramificazione più lunga un unico glucosio e sulla ramificazione intermedia un mannosio. Questa struttura viene riconosciuta dalla calnessina e dalla calreticulina che sono due proteine chaperon. Queste proteine, però, sono anche due lectine, ovvero riconoscono le porzioni oligosaccaridiche: in particolare riconoscono l’unico glucosio presente nel ramo lungo. Nel momento in cui avviene il riconoscimento da parte di calnessina e calreticulina viene richiamata la ERp57, una disolfuro isomerasi, che va a formare un ponte S-S intercatena tra se stessa e una cisteina della catena polipeptidica in folding. In questo modo ERp57 favorisce la formazione dei corretti ponti S-S all’interno della catena. Ad un certo punto questo complesso si stacca e la catena polipeptidica fa un tentativo di folding. Se il tentativo non è corretto la catena viene legata di nuovo dalle chaperon, se invece è corretto si ha un avanzamento nella configurazione nativa. il riconoscimento da parte delle chaperon delle catene polipeptidiche dipende dai patch idrofobici che espongono, quindi più la catena polipeptidica presenta patch idrofobici più l’equilibrio tra la forma intermedia libera e la forma legata alla chaperon è spostato verso la chaperon. Invece, più la catena polipeptidica è in folding, cioè va creando quegli intermedi in cui i patch idrofobici sono nascosti e mostra patch idrofilici, minore è il tempo di ritenzione di attacco con la chaperon. Nel momento in cui la catena polipeptidica viene liberata ed è correttamente foldata o cmq si trova in uno stadio molto avanti verso il folding, non viene riconosciuta dalla chaperon ma nuovamente dalla glucosdasi II, che stacca il glucosio e non verrà più riconosciuta dalla calnessina e calreticulina. A questo punto se è tutto apposto e ha superato questo primo controllo di qualità esce dal RE. Però può accadere che la proteina non sia nella sua configurazione nativa ma sia in una non nativa. Allora a questa struttura che ha perso il glucosio, non potendo essere più riconosciuta dalla calnessina e calreticulina e fare un nuovo tentativo di folding, le viene una seconda chance. Come? Interviene un enzima, l’UDP- glucosio-glicoprotein-glucosiltransferasi (UGGT), una transferasi che riattacca un nuovo glucosio alla glicoproteina utilizzando l’UDP- glucosio come donatore. A questo punto può essere riconosciuta dal complesso della calnessina e calreticulina e la catena polipeptidica può fare un nuovo o dei nuovi tentativi di folding. Se questi tentativi di folding continuano a non essere produttivi interviene una mannosidasi che va a staccare quel mannosio finale del ramo intermedio della struttura glicosidica. Nel momento in cui quest’ultimo viene staccato ci indica che la catena polipeptidica ha cessato di vivere, ovvero verrà riconosciuta dal sistema dell’EDEM per essere presentata all’ERAD. L’EDEM è una sorta di chaperon deputata al riconoscimento delle proteine definitivamente non funzionali e avviandole alla degradazione. Il riconoscimento dell’UGGT con il suo substrato avviene poichè riscontra nel substrato le seguenti caratteristiche:
        • Parzialmente strutturate
        • Con conformazione “molten globule”
        • Con clusters di patch idrofobici esposti
        Se la catena polipeptidica non ha esposto i patch idrofobici, anche se possiede le altre caratteristiche, significa che la catena è già correttamente foldata. Se l’intermedio che sta andando verso il folding non si trova in una di quelle condizioni, l’UGGT non lo riconosce e in tal modo quell’intermedio resta tale e libero nell’ambiente. Di conseguenza la concentrazione della catena polipeptidica aumenta e a questo punto entra in gioco la mannosidasi.
- - - - Com’è costituita la catena glicosidica?
        • 2 N-acetilglucosamine
        • 5 mannosi
        • 3 glucosi
        Per prima cosa questa catena viene costruita su un suo scheletro di dolicolo (struttura fortemente idrofobica che deriva dall'unità isoprenica ripetuta 9-22 volte) che entra nella sua forma attiva, ovvero dolicolo fosfato. Dal dolicolo fosfato si costruisce, sul versante citosolico, la catena glicosidica unendo come prima cosa 2 molecole di UDP- N- acetilglucosamina. Poi entrano 5 molecole di mannosio legate al GTP. I 5 mannosi cosi iniziano a costruire un ramo più lungo e un ramo più corto. A questo punto questa struttura a 2 + 5 monomeri legati flippa, ovvero ruota di 180° passano all’interno del lume del RE.Per operare questa reversione si deve superare una barriera energetica mostruosa rappresentata dal doppio strato fosfolipidico. Chi opera questa traslocazione? Le “Flippasi” (nome generico). una volta all’interno del lume, la catena deve completare la sua formazione, utilizzando ancora altri mannosi e i glucosi che vanno a completare questa ramificazione a 3 rami. Preformata questa catena, essa verrà legata con un legame n-glicosidico ad una specifica asparagina che si trova nella catena polipetidica che sta entrando. Vi ricordo che le catene oligosaccaridiche possono essere legate, nella formazione delle glicoproteine, o con un legame O-glicosidico o N-glicosidico. La “N” del legame N-glicosidico sta ad indicare che la catena oligosaccaridica viene attaccata all’asparagina. Cos’ha di particolare questo amminoacido? È la forma amminica dell’acido aspartico, la quale possiede il gruppo –NH2 nella catena laterale. Quindi legame N-glicosidico mi sta ad indicare che la catena oligosaccaridica è legata proprio a questo –NH2 dell’asparagina. Il legame O-glicosidico, invece, mi sta ad indicare che la catena viene legata ad un –OH degli amminoacidi carichi del gruppo OH.
- - - - Cos'è?
        
        È la necessità di portare fuori un’informazione che deve arrivare al nucleo perché il nucleo risponda all'ER stress. La risposta dell'UPR avviene su due livelli:
        
        livello post-trascrizionale, cioè ridurre il numero di catene polipeptidiche che entrano nel lume. Quindi come primo livello di risposta l’attenuazione della traduzione in maniera tale che si riducano il numero di catene polipeptidiche tendenzialmente non foldabili all’interno del lume.
        
        livello trascrizionale, che implica invece la sintesi di chaperon e di fattori della degradazione, in maniera tale di ridurre l’ER-stress, non solo perché diminuiscono le catene polipeptidiche che entrano ma perchè quelle che si stanno formando vengono degradate o gli viene consentito di fare un nuovo tentativo di folding. L’aumento della concentrazione delle chaperon serve anche per non trasformare queste catene polipeptidiche in unfunction cioè aggregarle e sequestrarle per evitare che mostrino il loro lato potenzialmente tossico.
      - Fattori dell'UPR
        
        Protagonisti dell'UPR sono tre fattori trascrizionali transmembrana attivati con percorsi differenti e che portano direttamente o indirettamente all’attivazione di eventi trascrizionali. Questi fattori fisiologicamente stanno in uno stato non attivo ma attivabile perché nel dominio intraluminare sono legate fisiologicamente alle BIP. Cosa accade? Nel momento in cui aumenta la concentrazione delle catene polipeptidiche misfolded nel lume del reticolo le BIP hanno una maggiore affinità per le catene polipeptidiche e si staccano dal dominio intraluminare dei fattori dell’UPR e vanno a tentare di neutralizzare il potenziale aggregativo di queste catene polipeptidiche misfolded. A questo punto, i tre fattori possono essere avviati alla loro attivazione. Il vero e proprio sensore del folding è la BIP, la proteina GRP68 che è la BIP più specifica del lume del reticolo. Nel momento in cui queste tre proteine vengono liberate da questo controllo regolativo negativo regolato dalle chaperon, si attivano.
        
        IRE1
        
        Come vengono attivati gli altri due fattori? IRE1 e PERK quando vengono attivate dimerizzano.
        IRE1: la dimerizzazione porta all’ attivazione dell’attività RNAsica, per cui il suo target è XDP1 che subisce un evento di splicing che stacca un introne e lo attiva. XDP1 poi andrà nel nucleo per attivare la trascrizione ma per attivare la trascrizione XBP1 ha bisogno di ATF6, quindi i tre fattori si attivano probabilmente contemporaneamente. è stato dimostrato che l’attivazione di IRE vede non soltanto il distacco di BIP ma si pensa anche che IRE passi per stadi differenti di attivazione e che tra uno stadio e l’altro dell’attivazione della sua attività RNAsica sia necessario non soltanto il distacco delle BIP e quindi la sua dimerizzazione ma addirittura la formazione di un oligomero più complesso, oligomero che viene attivato fisicamente dalle proteine unfolded. Quindi c’è una doppia attivazione uno stato non attivo non attivabile che la IRE1 legata alla BIP in forma monomerica, poi si passa ad uno stato non attivo ma attivabile in cui si stacca la BIP e la proteina inizia a dimerizzare, ma si trova in una forma in cui non riesce ad attivare l’attività RNAsica. L’attività RNAsica si attiverà quando il dominio citosolico, in cui è presente l’attività RNAsica, si swicha come se ruotasse di 180° e questo si realizza quando si sommano più eventi che sono: l’interazione con le catene polipeptidiche misfolded che si vanno a collocare lì e fanno anche da richiamo. Si forma l’oligomero richiamato dalle catene polipeptidiche e il passaggio dallo stato non attivo ma attivabile a quello attivo deve prevedere l’autofosforilazione di IRE.
        
        ATF6
        
        è legata alla BIP, quando questo lascia libero ATF6, ATF6 transita al Golgi dove nel incontra S1P e S2P che taglia liberando il fattore trascrizionale ATF6. ATF6 a questo punto va nel nucleo e va ad attivare la trascrizione di quei geni che codificano la risposta all’UPR.
        
        PERK
        
        ha una attività intrinseca, una attività chinasica autofosforilante che si attiverà nel momento in cui dalla sua forma monomerica si passa alla forma dimerica che consente l’attivazione dell’attività chinasica, la sua attivazione a cosa porta? Oltre ad essere fosforilata va a fosforilare il fattore EIF2α che è il fattore di inizio della traduzione. Questo fattore nel momento in cui viene fosforilato, viene reso meno attivo e questo lo potremmo considerare come prima risposta, viene bloccata la traduzione, quindi si riduce il numero di catene polipeptidiche che entrano nel lume del reticolo che andrebbero ad aggravare ulteriormente la situazione. Se il blocco è uno dei primi eventi, se si bloccasse completamente la traduzione non avrebbe alcun esito l’attivazione trascrizionale. In particolare PERK fosforilato va ad attivare anche ATFS4 che può arrivare al nucleo portando alla trascrizione di alcuni messaggeri che superano il fattore, cioè che hanno nella loro struttura, saltano il codone AUG di stop. È vero che questo meccanismo porta ad una riduzione generalizzata della traduzione, eccetto per mRNA che vengono sintetizzati a valle dell’attivazione a valle di ATF4, i messaggeri che non subiscono questo controllo negativo di EIF2α. . L’attivazione di ATF4 è importante anche per un altro motivo, ATF4 è un fattore di trascrizione deputato alla trascrizione di CHOP. Chop è un fattore trascrizionale che quando si attiva è responsabile dell’avvio alla morte per apoptosi e quindi l’attivazione alla fine di ATF4 che porta al primo livello delle chaperon e alla risposta antiossidante ma poi è l’anello di congiunzione tra i tentativi di rispondere all’UPR e lo swich che porta a morte per apoptosi. L’attivazione di Chop segue questi eventi e lo porta ad una sintesi ritardata.
- - - - Le subunità del traslocone sono alfa e beta. Quale funzioni hanno? Una ha il ruolo di riconoscimento, l’altra partecipa e apre il traslocone nel momento in cui va ad interagire con la struttura. il sistema del traslocone del Sec-61 può traslocare in un verso o nell’altro. Cos’è che varia? Non tanto quella che è la porzione stabile, ovvero quelle subinità e quell’organizzazione che crea il canale attraverso cui passa la catena, bensì le proteine accessorie. Per cui ritroviamo proteine stabili e strutturarli e proteine accessorie o regolative che regolano il verso della traslocazione. Per la traslocazione è necessaria un’energia data dall’idrolisi dell’ATP che avviene sulla Bip. Quest’ultima è la più importante Hsp del reticolo ed è, come tutte le chaperon, una proteina che è ATP dipendente.
    - - Sulla membrana
        
        p58
        
        ha il compito di convertire il traslocone in retro-traslocone, quindi di far cambiare verso al senso di marcia.
        
        E3 ligasi (HDR1)
        
        un enzima ubiquitinante che creano le catene di ubiquitina a livello della catena polipeptidica in modo che poi verranno riconosciute dal proteosoma. L’ubiquitinazione è fondamentale perché deve portare al proteosoma, perché se vi fosse una retro-traslocazione non associata alla ubiquitinazione quella catena polipeptidica se non può foldare nel lume e finisce nel citosol e non viene avviata alla degradazione abbiamo solo spostato il problema perché si creerebbero aggregati, quindi l’ubiquitinazione è un momento strategico importante.
        
        Derlina 1
        
        fanno parte di complessi legati nella retro-traslocazione. La derlina-1 viene considerato come l’alterego del sec61 che funziona in maniera opposta, quindi è un sistema di retro-traslocazione differente dal sec61.
      - Versante citosolico
        
        p97
        
        p97 lega l'ubiquitina e rappresenta la forza motrice che determina la direzione del trasporto. p97 appartiene alle AAA proteins cioè delle proteine che sono delle ATPasi che utilizzando l’energia di idrolisi di ATP convertono l’energia di idrolisi dell’ATP in energia, in forza meccanica di traino. Quindi questa catena polipeptidica viene tirata sul lato del citosol da queste AAA.
      - Versante luminare
        
        Disolfuro reduttasi
        
        che va a ridurre i ponti s-s perché questo è un ritorno indietro verso uno stato più lineare che permette prima di passare attraverso il canale, perché il canale fa passare le sequenze “in struttura primaria” ma altrettanto in struttura primaria è la catena che entra nel proteosoma.
        
        GRP94
        
        che fa parte della famiglia delle HSP90. La GRP94 da una parte riconosce le catene intraluminarie specifiche ma nello stesso tempo le riconosce misfolded e quindi tampona il potenziale tossico di queste catene polipeptidiche.
        
        OS9, OS7 e XTP3-B
        
        lectine lectine deputate alla traslocazione di polipeptidi misfolded con un basso numero di mannosi.
- - - - È’ un complesso formato da diverse subunità che vanno ad interagire con un’RNA di circa 300 nucleotidi. Queste subunità hanno differenti funzioni come le P9/P14 che interagiscono con il ribosoma, le P68/P72 necessarie per la traslocazione, ma fondamentale per il funzionamento è la subunità P54 la quale possiede una serie di metionine, attraverso le quali riconosce la sequenza segnale. (la metionina è un amminoacido costituito da uno zolfo a cui è legato un gruppo metile. Quest’ultimo può essere ceduto solo se la metionina si trova nel suo stato attivo, ovvero la s-adenosinmetionina (SAM), attivata legando il nucleoside che deriva dall’ATP. In tal modo lo zolfo forma un legame in più e indebolisce il legame S-CH3 rendendo il gruppo metile disponibile per essere ceduto ad opera della metioninadenosintransferasi)
    - - Per proteine transitorie
        
        Essendo riconosciuta dai gruppi metili delle metionine, chiaramente la sequenza segnale sarà idrofobica. si trova all’N-terminale o leggermente più interna ed è costituita da 16-30 amminoacidi. Importante è la sequenza di 6 o 12 amminoacidi idrofobici, che può essere preceduta da amminoacidi carichi positivi, e rappresenta il core della sequenza segnale che viene riconosciuta dalle metionine esposte.
      - Per proteine residenziali o che devono essere retro-traslocate
        
        Un’altra sequenza segnale che può essere associata alle catene polipeptidiche che sono residenziali o che devono essere traslocate indietro per essere indirizzate alla degradazione, è la sequenza KDEL. Quest’ultima rappresenta il segnale di retrotraslocazione e di ritenzione luminare ed è posizionato non all’N-terminale ma bensì al C-terminale.