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IMPORT MITOCONDRIALE (UPR (Il sistema di qualità se si accorge che vi è…

- - - - Il versante anfipatico della presequenza viene riconosciuto da Tom20 che ha vengono esposti dei residui idrofobici che faranno delle interazioni idrofobiche con la presequenza, quindi il VERO E PROPRIO RICONOSCIMENTO avviene nel versante citosolico della MME. A questo punto attraverso una modifica conformazionale cui il versante carico positivamente della presequenza viene riconosciuto da Tom22 proteina transmembrana, che sulla base del fatto che Tom22 possiede sia sul dominio citosolico che sul dominio transmembrana delle cariche negative che interagiranno con le cariche positive presenti sul versante alfaelica della presequenza. Nel momento in cui avviene questa interazione avviene sempre una modifica conformazionale tale che la proteina adesso si trova nell’angolazione ideale per poter attraversare Tom40 (il canale). Tom40 era costituito da due subunità che si organizzano a formare 2 canali che fanno passare la catena polipeptidica, è certo che i 2 canali non funzionano contemporaneamente per proteine diverse, cioè non può passare dal primo una catena polipeptidica e dal secondo un’altra, ma entrano in gioco quando devono passare proteine politopiche. La forza di trazione è data dalle carfiche negative del versante transmembrana di Tom 22 che richiama le cariche positive della pre-sequenza. A questo punto la proteina che emerge nello spazio intermembrana deve passare nella matrice: Tom22 va a riconoscere e richiamare il complesso TIM23 sulla MMI, creando un unico grande canale. La membrana mitocondriale interna ha un gradiente di potenziale chemiosmotico, ma TIM23 è un canale, un buco, che se restasse aperto potrebbe dissipare il gradiente chemiosmotico; per cui sembra che Tim50 generi una sorta di cappuccio che tiene chiuso il complesso TIM23 quando non ci sono presequenze in arrivo. Ma quando arriva la presequenza si deve verificare una modifica conformazionale che faccia aprire Tim50, in maniera tale che la presequenza che sta emergendo da TOM possa entrare da TIM Come? Fondamentale nella traslocazione è il gradiente chemiosmotico (∆Ψ) che si forma con la fosforilazione ossidativa della catena respiratoria, che non serve solo per formare ATP o calore nel tessuto adiposo bruno (termogenina), ma parte di tale gradiente viene dissipato nei processi di traslocazione. un’altra forza trainante importante ATPdipendete è data dal complesso PAM complesso che si viene a creare nel momento in cui attraverso TIM23 sta passando una catena polipeptidica con la presequenza che deve arrivare alla matrice. PAM è essenziale affinchè la catena polipeptidica completi il suo folding perché PAM contiene la MPP che è la peptidasi delle proteine mitocondriali, cioè l’enzima (è un endopeptidasi) che va a tagliare la presequenza, perché se non si taglia la presequenza il folding non si può completare. fra i componenti di PAM vi è un Hsp70 mitocondriale, che è una chaperon (è la più diffusa) fondamentale perché guida il folding della catena polipeptidica in quanto deve interagire con essa per evitare i patch idrofobici: la proteina farà un primo tentativo di folding; se non va bene si rilega l’Hsp70 che utilizza l’energia data dall’ATP rompe i legami scorretti e la rilascia. Continua così finché non si folda correttamente. Vicino vi è Mge1 che è una GEF (fattore di scambio dei nucleotidi) che deve ricaricare di ATP l’Hsp70 così essa possa svolgere il suo ruolo
- - - - Le strutture beta-barrel ed alfa-eliche sono le strutture più apolari e con più capacità aggregante che ci siano. Per cui nella traslocazione di queste proteine che hanno già un livello strutturale di organizzazione più avanzato e per giunta di patch idrofobici, serve un controllo più selettivo perché vi è il rischio che formino aggregati. Fondamentale sia citosoliche che dello spazio intermembrana che sequestrano questi patch idrofobici. Quindi, Le catene polipeptidiche che possono formare il beta-barrel vengono subito sequestrate dalle chaperon citosoliche come Hsp70. Le proteine beta-barrel vengono riconosciute da Tom20 e Tom22, poi emergono nello spazio intermembrana e vengono sequestrate immediatamente da 2 piccole Tim, Tim9 e Tim10. Queste Tim sono particolari perché che hanno come configurazione nativa la configurazione del “Molten Globule”, in cui le strutture secondarie si sono pre-formate ma non si sono compattate, non hanno formato tutti quei legami deboli che vanno a stabilizzare la struttura terziaria, è quella struttura che gli consente di svolgere la loro funzione. Queste si organizzano in gruppi da 6 e si viene a creare una sorta di letto su cui si adagiano i patch idrofobici dei foglietti beta. da Tim9 e Tim10 che le fanno adagiare sul letto, e le traslocano al complesso SAM. Questo è il complesso deputato al riconoscimento e probabilmente partecipano al completamento del folding ed emerge il beta-barrel. SAM ha una proteina accessoria che è Mdm10 che serve per la traslocazione.
    - - sono riconosciute dal complesso TOM, in cui il riconoscimento avviene con altre subunità regolative come Tom70. Tom70 funziona come struttura macromolecolare, sono 3 dimeri (quindi sono 6) su cui si poggiano le alfa eliche , e fa da recettore di riconoscimento. TOM è formato da Tom70 e Tom40 ( il canale). . Attraversato Tom40, vengono legate da Tim9 e Tim10 che le presentano al complesso Tim22. Vi sono 3 catene e 2 pori, il meccanismo che gestisce il passaggio è la diversa affinità e capacità di interazione con le Tim. Prima passeranno le due coppie di α-eliche che hanno minore affinità per Tim9 e Tim10 e maggiore affinità per il canale; la terza coppia ha maggiore affinità per Tim9 e Tim10 e minore per il canale e passerà dopo. L’energia che permetterà il passaggio attraverso il canale è data dalla differenza di potenziale, che localmente viene creata e mantenuta dai complessi della catena respiratoria adiacenti.
- - - - Lo stress ossidativo si innesca quando, o aumentano i ROS al di sopra dei sistemi antiossidanti della cellula, o la concentrazione dei ROS resta costante, ma si riducono i sistemi antiossidanti (ciò accade nell’invecchiamento). invecchiamento fisiologico, si può contrastare introducendo dall’esterno sistemi antiossidanti (vitamina E, colesterolo, acido arachidonico,ecc.)
        
        ROS
        
        Specie reattive dell'ossigeno
        
        OH° (la più tossica non si può contrastare)
        
        O2-
        
        ciclo dell’ubichinone. Entra il primo ubichinolo con i 2 elettroni e cede 1 e- al citocromo c e un altro e- va al citocromo b, il citocromo b lo cede ad un secondo ubichinone trasformandolo in semiradicalica dell’ubichinone, quando entra un secondo ubichinolo cede un e- al citocromo c e l’altro al citocromo b che lo trasferirà alla specie semiradicalica dell’ubichinone trasformandolo in ubichinolo. La debolezza sta nella formazione di questa specie semiradicalica che può cedere questo elettrone all’ossigeno formando O2-.
        
        H2O2
        
        Specie reattive dell'azoto
        
        NO (ossido d'azoto) metabolita gassoso che fisiologicamente fa parte delle vie metaboliche ma può accadere che in presenza dell'anione superossido O2- si formi il perossinitrito acido, un potente agente ossidante
        
        Sistemi anti-ossidanti
        
        Compartimentazione
        
        Si tenta di compartimentare le specie reattive dell’O2 all’interno dei perossisomi
        
        Glutatione perossidasi
        
        . La glutatione perossidasi, che ha come cofattore il selenio, riduce H2O2 a H2O. Il glutatione ossidato perde la sua funzione e deve essere nuovamente ridotto, a ridurre è la glutatione reduttasi FAD-dipendente, che usa come agente riducente il NADPH che viene ossidato a NADP. Il glutatione è un tripeptide, non esiste gene che lo codifica, perché il legame tra glutammato e cisteina è un legame peptidico anomalo, tra gruppo carbossilico della catena laterale del glutammato e gruppo amminico della cisteina.
        
        Enzimi come la catalasi e SOD
        
        . La superossido dismutasi trasforma anione superossido (O2-) in acqua ossigenata (H2O2). L’acqua ossigenata a sua volta diventa substrato della catalasi. La catalasi riduce due molecole di H2O2, formando due molecole di H20 e una molecola di O2.
- - - - In condizioni ottimali, in presenza di O2 e glucosio, la PKA è mantenuta in uno stato inattivo, il precursore di Tom40 può passare e il complesso si forma correttamente. In questo stato di benessere il mitocondrio deve essere perfettamente funzionante, deve produrre ATP.
      - A basse concentrazioni di O2 e di glucosio, PKA verrà attivata. PKA attiva va a fosforilare a livello della serina Tom40, impedendone la corretta localizzazione. Il mitocondrio viene silenziato nella sua attività e viene silenziato silenziandone anche la sua organizzazione mitocondriale. Perché la fosforilazione sulla serina inibisce l’import? Perché il fosfato è carico. Il fosfato lega la serina54, siamo nella porzione vicino all’N-terminale, magari questa serina va a collocarsi sul versante anfipatico della pre-sequenza e quindi queste cariche negative del P, impediscono il riconoscimento da parte della conca idrofobica della Tom20
    - - In condizioni ottimali, presenza di O2 e glucosio, si attiva la CK2 che è in grado di gestire positivamente i percorsi di import. Lo gestisce positivamente perché va a fosforilare altri precursori e subunità dei complessi proteici, funzionando da attivatori del percorso.
      - In condizioni fermentative, basse concentrazioni di O2 e glucosio, CK2 è inattiva e l’import non funzionerà, i precursori dei complessi proteici restano nel citosol, non vi sarà raggiungimento della configurazione nativa e raggiungimento della corretta localizzazione. Questi precursori verranno probabilmente degradati.
- - - - Fusione - fissione
        
        La fusione consiste nel fatto che un certo numero di mitocondri possono riorganizzarsi e fondere in super mitocondri o ipermitocondri che possono rimiscelare tutte le componenti. Se prima avevamo un mitocondrio con funzionalità 10, uno 5 e uno 0, sommandoli e dividendo per 3 otterremo 3 mitocondri che potrebbero essere tutti e tre funzionali, anche se non al 100% ma tali da sopperire alle esigenze energetiche della cellula. la fissione: un mitocondrio totalmente inefficiente che non possiamo recuperare, possiamo avviarlo alla degradazione. Quindi si riduce il numero di mitocondri a livello della cellula ma in questo caso noi abbiamo eliminato il mitocondrio che non funzionava, lasciando quelli funzionanti a sostenere le esigenze metaboliche della cellula. evitiamo che quel mitocondrio, con un meccanismo autogenerante, genera altri ROS che possono uscire e creare danno ossidativo.
    - - il processo apoptotico evita che ci siano delle risposte di processi necrotici che poi possono compromettere la vita delle altre cellule. Quindi è una linea di difesa l’apoptosi e non il punto finale di qualcosa che non abbiamo recuperato. Nella fusione-fissione, oltre alla distribuzione e alla mitofagia, entra in gioco anche l’apoptosi. Questi tre livelli di difesa dobbiamo considerarli, non tanto in rapporto alla scala di stress ossidativo, di danno, di incremento della concentrazione dei ROS, ma dobbiamo vederli in rapporto a quanto questa scala si va allargando o stringendo, e questo dipende dal momento e dalla condizione. Se c’è un elevato danno, che porta alla ubiquitinazione massiva degli elementi della membrana mitocondriale esterna, allora la fusione verrà bloccata e si attiva la mitofagia o l’apoptosi. con l’attivazione della mitofagia noi blocchiamo l’apoptosi, perché la mitofagia consente a quel mitocondrio di salvare la cellula. Quindi se sta partendo la realizzazione dell’evento mitofagico automaticamente i percorsi apoptotici vengono inibiti. Se partissero entrambi i percorsi contemporaneamente cosa succederebbe? L’apoptosi ha bisogno di energia, ma se stiamo degradando il mitocondrio per mitofagia allora non c’è energia e dunque l’apoptosi non arriverà mai a buon fine e diverrà necrosi.
    - - cioè la possibilità di ricontrollare e mantenere efficiente il mitocondrio. Questo possiamo farlo attraverso due vie: attivare la sintesi di nuove chaperon, in modo tale che , vanno a interagire con le proteine ossidate facendo si che queste proteine possano fare un nuovo tentativo di folding; dall’altra parte, se le proteine ossidate non riescono a ritornare sulla retta via vengono avviate alla degradazione. . Il controllo di qualità è rappresentato dal monitoraggio da parte delle proteasi, enzimi che degradano le proteine, localizzate differentemente in maniera tale da rispondere e riconoscere proteine ossidate in tutti e quattro i subcompartimenti mitcondriali.
        
        SI
        
        HtrA2
        
        OMA1
        
        è una serina proteasi che si trova nello spazio intermembrana e svolge un ruolo fondamentale: riesce, grazie all’attività proteasica, a gestire l’attivazione dei fattori apoptogenici mitocondriali.
        
        MMI
        
        AAA-proteasi
        
        AAA-proteasi, distinte in i-AAA, sito catalitico verso lo spazio intermembrana, m-AAA sito catalitico verso la matrice. Degradano le proteine misfolded nello spazio intermembrana (i-AAA), sulla matrice (m-AAA). Sono due complessi identici posizionati in modo “testa-coda”. le AAA proteins? Sono delle AA – ATPasi. cioè sono delle proteine che svolgono la loro attività utilizzando l’energia di idrolisi dell’ATP. questa energia di idrolisi viene convertita questa energia chimica in forza meccanica , la forza meccanica che serve ad esempio a defoldare/far tornare indietro il grado di organizzazione tridimensionale delle proteine ossidate.
        
        MME
        
        Sistema ubiquitina-proteosoma (interessa proteasi sul versante citosolico della MME)
        
        Pathway PARL-Pink-Parkina
        
        PINK1 è una proteina chinasi che viene sintetizzata dal genoma nucleare e deve raggiungere la membrana mitocondriale interna. Attraversa TOM e va su TIM. Quando arriva su TIM, essendo PINK 1 una proteina con segnale di sorting transmembrana + segnale di sorting,viene staccata la sequenza grazie alle proteasi MPP presenti sulla matrice. : Che tipo di complesso sarà TIM visto che verrà tagliata la sequenza? Avremo TIM 22 associato a TIM 23. Quando PINK1 raggiunge la sua localizzazione, arriva PARL, un enzima che andrà a degradare PINK 1. Quindi se tutto va bene PINK1 viene sintetizzata, passa attraverso TOM, raggiunge TIM con i percorsi che conosciamo, si localizza sulla membrana, viene riconosciuta da PARL, localizzato anch’esso sulla membrana, e degrada PINK 1. Questo è un meccanismo di defult, ovvero la proteina viene sintetizzata a priori, se non serve viene degradata, se c'è un problema allora la proteina agisce. PINK1 raggiunge la sua destinazione a patto che ci sia la forza che “guida” questo processo, ovvero il delta di potenziale (ΔΨ). Nel momento in cui c’è un danno al dna che porta a una caduta della differenza di potenziale sulla membrana mitocondriale interna, manca la forza trainante per PINK1, quindi PINK1 resta su TOM40, non può essere traslocato. PINK 1 agisce su questo versante e richiama Parkina, un enzima III ligasi responsabile della ubiquitinazione e quindi un componente del sistema ubiquitina-proteosoma. A questo punto parte la risposta, che in un primo livello potrebbe essere la degradazione di queste proteine ubiquitinate che vengono riconosciute come ubiquitinate e conseguentemente richiamo del proteosoma, oppure il secondo livello, ovvero un’induzione alla mitofagia, perché l’ubiquitinazione delle proteine porta al riconoscimento di queste proteine ubiquitinate di p62. p62 è un componente essenziale del processo autofagico ed è una proteina che riconosce le proteine ubiquitinate. . PINK1 rientra sia nel primo che nel secondo livello. Al primo livello perché nel momento in cui l’ubiquitinazione è circoscritta richiama il proteosoma (livello di controllo di qualità molecolare) che degrada le proteine ubiquitinate perché erano ossidate. Se il danno è maggiore l’ubiquitinazione più ampia attiva il processo mitofagico (livello di controllo di qualità organellare)
        
        Matrice
        
        Lon
        
        . Lon è più selettiva di Clp, ha substrati specifici, tra questi l’aconitasi. riconosce determinate proteine, non riconosce lo stato ossidato o non ossidato, ma riconosce specifiche proteine se sono ossidate o meno.
        
        Clp
        
        ClpXP presenta una peptidasi che è la porzione del core di questa macchina della degradazione che è la ClpP e poi posside la ClpX, ovvero la porzione regolativa con attività defoldasica, che serve a far tornare indietro l’organizzazione strutturale/tridimensionale della proteina, e con attività traslocasica per far entrare dentro, non la proteina, ma la catena polipeptidica con un livello di organizzazione estremamente basso. Questo avviene come nel proteosoma 26S. Quindi riconosce e degrada le proteine misfolded e nello stesso momento, nell’ambito di controllo di qualità, sembra che Clp possa rilasciare dei piccoli peptidi che sono dei segnalatori, dei messaggeri centripeti che portano informazioni al di fuori del mitocondrio.
      - Sistema Malm
        
        Un altro tentativo di gestione della degradazione è il sistema MALM. Nel momento in cui i sistemi di protezione ATP dipendenti non possono funzionare per carenza energetica, quindi siamo in un alto stadio di stress ossidativo, si attiva il MALM. che in condizioni di stress all’interno del mitocondrio ci sono delle strutture: gli pseudolisosomi. l’aumento dei ROS e la diminuzione dell’ATP fa si che organuli lisosoma-like interagiscono con una proteina, Mieap, che va a circoscriverli e con un meccanismo di import va all’interno del mitocondrio. Nel mitocondrio questi riescono ad attivarsi per differenza di pH e potrebbero selettivamente degradare ciò che è danneggiato e li utilizza a scopo energetico. possiamo intervenire nella riduzione di ATP degradando specificatamente quelle molecole non funzionali presenti nel mitocondrio in quel momento. Lo possiamo collocare a cavallo tra il primo e il secondo livello di difesa, perché è un livello di difesa che si esplica come evento molecolare in quanto vengono degradate delle molecole ma che sono contestualizzate all’interno del mitocondrio con un processo lisosomiale.
  - - - CHOP
        
        CHOP non lavora in singolo, come la maggioranza di fattori trascrizionali, ma sotto forma dimerica e la risposta della trascrizione dipenderà dal tipo di dimero che CHOP può formare, di quali geni vengo indotti alla trascrizione. può accadere che l’attivazione di CHOP possa attivare la trascrizione di molecole apoptogeniche come le proteine della famiglia Bcl2, che modulano gli eventi di membrana perché formano i canali attraverso cui escono i fattori apoptogenici mitocondriali. Questo potrebbe essere una sorta di preparazione a qualcosa che può avvenire. conflitto tra l’attivazione mitofagia e apoptosi a gestire se l’apoptosi andrà avanti o meno. Intanto si prepara tutto affinchè l’apoptosi si possa realizzare, se poi parte prima la mitofagia e mi va a bloccare l’apoptosi, ben venga! Ma se la mitofagia dovesse non funzionare, perchè la cellula doveva andare a morte, è meglio se ci va per apoptosi, quindi io preparo la cellula perché possa morire per apoptosi evitando il danno.
      - ROS
        
        I ROS a bassa concentrazione sono mediatori intracellulare. molte proteine possono essere ‘ossidate’ dai ROS, ossidazione quantica di uno o due residui di cisteina,tirosina, che possono essere reversibilmente ossidate; quella proteina può attivarsi o inibirsi in rapporto al suo stato e quindi essere una proteina post-traduzionale come le altre
        
        Ad esempio possono intervenire nella trasduzione del segnale generata da un fattore di crescita. Questo va ad attivare la PI3K, che a sua volta va ad attivare la NADPH ossidasi, un enziima che ossida il NADPH a NADP. Inoltre questa ossidasi ossida l'O2 producendo O2-. L’O2•- viene rilasciato nell’ambiente extracellulare e ad opera della superossido dismutasi si trasforma in H2O2, che in questo percorso sembrerebbe essere il mediatore, perché H2O2 prodotta nell’ambiente extracellulare rientra nella cellula o per diffusione o attraverso canali come le acquaporine. Una volta dentro la cellula, l’acqua ossigenata è in grado di ossidare uno specifico residuo di cisteina che si trova su tutta una serie di target che rispondono a quel fattore di crescita. Questi target non vengono ossidati ma subiscono un’ossidazione su uno specifico residuo di cisteina che una volta ossidata forma ponti S-S, ovvero un legame forte che stabilizza la proteina. Quella proteina cosi stabilizzata resiste di più ad un turnover più lento e quindi funziona di più.
        
        è stato dimostrato che in presenza di ROS dal ponte S-S c’è la formazione dell’anione tiolato, in cui le due cisteine non sono due SH ma è un SH ed S-. In presenza di ROS questo S- diventa SOH, quindi viene a formarsi l’acido sulfenico, questa rappresenta transitoriamente uno stato differente della proteina. Quindi l’aumento dei ROS agisce specificatamente su residui di cisteina o in modo canonico, ovvero stabilizzando transitori ponti S-S, oppure creando all’interno della proteina la forma di acido sulfenico che a sua volta può formare ponte S-S e ritornare indietro.non sono cisteine qualcunque ma specifiche cisteine. Le specie reattive dell’ossigeno vanno ad ossidare le proteine in maniera aspecifica, il cui risultato è o un aumento della stabilità della proteina, o un aumento delle sue funzioni o, al contrario una sua inattivazione, oppure una traslocazione. NRF2 è il più importante fattore di trascrizione che risponde allo stress ossidativo. NRF2 ha una localizzazione non nucleare, ad una sua attivazione attraverso l’ossidazione di specifiche cisteine ne determina la sua traslocazione nel nucleo. A questo punto NRF2 agisce come fattore trascrizionale che ha come target tutti i sistemi antiossidanti.
      - ATFS1
        
        è una molecola che si trova nel citosol e fisiologicamente può transitare nel mitocondrio. Quando va nel mitocondrio viene degradata da LON Se invece il mitocondrio va in sofferenza, ATPF non entra nel mitocondrio e resta nel citosol accumulandosi. La particolarità di ATFS1 è quella di possedere segnale di localizzazione nucleare. Quindi per default mostra il segnale di localizzazione mitocondriale. Quando si accumula nel citosol mostra il segnale di localizzazione nucleare e va nel nucleo attivando la trascrizione di tutte quelle proteine che devono rispondere allo stress.
      - Singoli peptidi
        
        Le macchine della degradazione (il proteosoma e AAA proteasi) in genere non degradano mai fino ai singoli amminoacidi ma degradano rilasciando piccoli peptidi, che non devono essere immunogenici ovviamente, perché altrimenti possono essere letti come non-self innescando una risposta immunitaria. Normalmente, quando il proteosoma fisiologico rilascia questi peptidi vengono degradati da endoproteasi, presenti nel citosol, che si occupano di degradarli fino all'ultimo aa, in modo tale da essere riutilizzati. Invece può accadere che questi peptidi siano essi stessi dei segnalatori che possono trasmettere informazioni al nucleo.