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FOLDING DELLE PROTEINE (Modelli di folding (Molten globul. Formazione…

- - - - On - pathway
        
        Rappresentano i coni più piccoli delle pareti dell'imbuto termodinamico. Essi sono necessari per il raggiungimento della configurazione nativa. Non è detto che tali intermedi abbiano strutture (alfa eliche, foglietti beta, strutture supersecondarie) che si ritroveremo nella configurazione nativa, possono servire transientemente per procedere verso il folding. per cui due regioni che prima erano lontane, ma che devono andare ad interagire, possono interagire e formare una determinata struttura, poi quell'intermedio che ha creato le condizioni può non servire più e a quel punto può tornare indietro. Questi intermedi riescono ad uscire da queste discese energetiche; ciò viene effettuato nella stragrande maggioranza dei casi dalle chaperon ATP-dipendenti che conferiscono a questi intermedi quell’energia che gli permette di risalire nella scala di energia libera per poi scendere lungo il giusto percorso.
      - Off - pathway
        
        Man mano che si scende lungo l’imbuto termodinamico la struttura si va organizzando e ordinando sempre di più, ordine che coinvolge l’intera catena polipeptidica e che determina una maggiore difficoltà nell’uscire dagli intermedi (graficamente i coni sono più profondi) con la probabilità che diventino off pathway. da questi la catena polipeptidica non riesce a uscire perché bisognerebbe somministrare una quantità di energia molto elevata, che le chaperon non possono soddisfare. Questi picchi diventano quindi trappole cinetiche da cui la catena polipeptidica non esce più. Quando l’energia libera di questi intermedi è molto vicina, paragonabile a quella della configurazione nativa si hanno proteine misfolded, che quindi staranno generalmente molto in basso nell’imbuto termodinamico vicino al picco che corrisponde alla configurazione nativa, dove le chaperon non possono più intervenire. Più i coni sono vicini (configurazione nattiva e configurazione misfolded) più sono le probabilità di evolvere nell’una o nell’altra. Infatti esse sono molto simili, si tratta di configurazioni ugualmente stabili.
      - PUF
        
        gli intermedi possono rappresentare una sorta di configurazione nativa transiente che porta la proteina vicina allo stato folded. In altre parole la catena viene fatta avanzare nel percorso di folding fino ad un certo punto e lasciare come se fossero in stand by, in uno stato non foldato ma foldabile, intermedi che possono facilmente e velocemente cadere nella configurazione nativa quando quella proteina deve servire o quando legherà il suo specifico ligando.
      - Molten globul
        
        in cui tutti gli elementi secondari sono già stati formati e manca il collasso idrofobico cioè l’impacchettamento di queste strutture secondarie e il loro compattamento per passare alla struttura nativa. Questo stato di molten globul può rappresentare per alcune proteine lo stato definitivo cioè lo stato nativo come per le TIM 9 e TIM 10 che per la loro funzione hanno bisogno di queste strutture secondarie esposte perché devono interagire con le regioni idrofobiche delle proteine che stanno emergendo da TOM.
    - - possono essere tutti potenzialmente presenti nella cellula perché ciascuna proteina ha teoricamente il suo imbuto termodinamico. Non c’è un imbuto migliore dell’altro. Il tipo di imbuto che può avere una proteina dipende sostanzialmente dalla
        complessità delle sue strutture secondarie.
        
        Campo da golf. regioni esterne ampie caratterizzate dallo stesso livello di energia che equivalgono a numerosissime configurazioni possibili.
        
        Imbuto liscio. folding della ribonucleasi a di Anfinsen, in cui le pareti sono estremamente lisce. Nulla ci vieta di pensare che esistano comunque intermedi molto poco stabili, molto veloci, che non riusciamo a individuare.
        
        Intermedio obbligato. imbuto dove c’è una ciambella con un intermedio obbligatorio a più bassa energia (avvallamento). Qualunque sia il percorso bisogna passare da questo intermedio.
        
        Imbuto rugoso. imbuto termodinamico con trappole cinetiche. Ovviamente queste trappole sono tali nel momento in cui la proteina difficilmente può uscirne.
- - - - lavorano in maniera ATP- indipendente ed entrano in gioco per aiutare l’aggregazione formando dei complessi costantemente presenti fin quando le condizioni non si modificano, e quindi più legate ad una condizione di stress
    - - Canoniche
        
        aiutano il folding delle catene polipeptidiche in condizioni fisiologiche
      - Inducibili
        
        la loro concentrazione viene fortemente stimolata da una condizione di stress
    - - sono uno specifico sottogruppo di chaperone molecolare che assiste il folding e prevengono l’aggregazione, quindi fanno tornare indietro ciò che si forma, formano dei cicli e sono ATP-dipendenti
  - - - Le chaperone Hsp90 sono un esempio di chaperone con funzioni specializzate, perché svolgono il ruolo canonico in condizioni di stress, ma in condizioni fisiologiche si organizza per mantenere le catene in uno stato attivo ma attivabile, quindi sono di fatto chaperone regolative del corretto folding di catene specifiche che vengono definite “clienti”, mantenendole in uno stato non foldato fin quando non sono necessarie. Tra le catene clienti vi sono i fattori trascrizionali, come ad esempio i recettori per gli ormoni steroidei , spesso proteine chinasi che devono raggiungere il nucleo, complessi del citocromo ecc.. Le Hsp90 sono dunque un hub, centro di smistamento. Le Hsp90 necessitano nella loro attività di una serie di co-chaperone che escono dal loro ciclo che vanno incontro ad una serie di modifiche post traduzionali che a loro volta ne regolano la funzione.
        Ancora una volta il meccanismo che viene attuato è gestito dal ciclo dell’ATP; per poter determinare il folding delle catene nel giusto contesto. Si riconoscono almeno quattro tipi di Hsp90 a seconda dei target: Hsp90 mitocondriale, Hsp94 reticolare e quella intraluminare, e le Hsp90 canoniche che si trovano nel citosol.
        In una condizione di stress che porta ad un aumento dei target non correttamente foldati, le Hsp90 svolgono il loro ruolo coadiuvate da co-chaperone Hsp70 e Hsp40 sequestrando queste catene a diverso potenziale tossico. In condizioni fisiologiche agisce su target clienti stabilizzandole in uno stato non foldato ma foldabile, non attivo ma attivabile, insieme all’aiuto di altre proteine, fin quando non avviene un evento tale da cambiare le condizioni ed indurre il folding completo. Molte di queste proteine clienti citiamo le Src (sarc, proteina oncogenica),le Cdk (chinasi dipendenti dalla ciclina), il fattore eIF-2α, i NOS, gli SHR (recettori per gli ormoni steroidei Raf (proteina di legame con Ras). Gli eventi che inducono le Hsp90 a permettere il definitivo folding delle catene sono ad esempio, la fosforilazione per Src, il legame di Ras per la proteina Raf, la produzione ed interazione degli steroidi specifici per gli SHR e così via. Da un punto di vista strutturale le Hsp90 sono costituite da un dominio di legame all’ATP con attività ATPasica, seguita da una regione che fa da “snodo” e poi la regione terminale. Queste chaperone funzionano come dimero appaiato e nel momento in cui l’ATP si lega avviene una modifica conformazionale che fa chiudere la struttura con all’interno il substrato da foldare. Quando la struttura della chaperone è aperta, dunque, riconosce il substrato inattivo; viene legata l’ATP con conseguente chiusura della struttura e si ha una struttura clamp che agisce con una serie di altre proteine associate. La catena da foldare viene accompagnata da Hsp70-Hsp40 con l’aggiunta, per queste proteine clienti, della proteina HIP. Sull’altro versante abbiamo il dimero Hsp90 legato ad HOP. L’interazione tra questi due complessi avviene mediante il riconoscimento tra le co-chaperone HIP e HOP. HOP, HIP, Hsp40 e Hsp70 vengono allontanate perché non devono più agire, ma intervengono altre due co-chaperone, IP e p23, per la maturazione del recettore per gli ormoni steroidei che passa da una conformazione non attivo-non attivabile (non legante l’ormone) ad una conformazione non attiva-attivabile (legante l’ormone). Il passaggio di SHR allo stato attivo avviene in presenza dell’ormone steroideo che viene può essere legato dal suo specifico recettore. Tutto regolato dal tipico ciclo dell’ATP. L’attività delle Hsp90 viene regolata anche mediante acetilazione, modifica post traduzionale. Lo stato attivo delle Hsp90, e quindi capace di formare il complesso per svolgere la sua funzione, è deacetilato; l’acetilazione determina invece la sua inattivazione. Quindi le Hsp90 sono sottoposte all’azione regolativa delle HAT e delle HDAC, acetilasi e deacetilasi rispettivamente.
    - - La proteina HOP non si trova solamente legata alle Hsp90, ma è anche capace di creare complessi multiproteici con proteine differenti quali ad esempio HSF1 che è un fattore di trascrizione, oppure con Hsp104 che intervengono da disaggregasi, cioè Hsp capaci di riconoscere un aggregato e staccare le subunità che lo compongono mediante un meccanismo a leva che sfrutta l’energia di idrolisi dell’ATP. Le parti dell’aggregato che vengono staccate, vengono riconosciute e prese in consegna dalle Hsp70, le quali evitano che possano ritornare ad aggregarsi.
- - - - sono complessi macromolecolari di cui la singola subunità ha un peso molecolare di circa 60 KDa. tra una chaperonina batterica ed una chaperonina eucariotica è tutto molto simile, tranne il fatto che la porzione GroES non è a se stante, libera, ma è una porzione che si allunga dalla stessa subunità della Hsp60, ovvero di quello che è GroEL; da un punto di vista genetico è una sorta di evoluzione, il gene GroEL si è fuso con il gene GroES dando origine ad un unico gene e, di conseguenza, un’unica struttura. Un esempio è TRiC, avente una regione equatoriale, una intermedia e poi quella apicale che si chiude su stessa nel momento in cui è necessario chiudere la struttura. Il riconoscimento ed il ciclo dell’ATP avvengono allo stesso modo: si ha il riconoscimento della substrato non foldato con rilascio di ADP e la sua conseguente sostituzione con ATP, passaggio che induce ad una modifica conformazionale che chiude la struttura similmente a ciò che avviene per le chaperonine batteriche.
    - - sono due “ring” (anelli) di cui uno cis e l’alto trans, disposte in posizione testa-coda dal lato della testa creando una struttura simmetrica; ciascun ring è formato da due omoeptamerici (7 subunità identiche tra loro) organizzati in una struttura a beta-barrel. All’interno di queste subunità riconosciamo due porzioni centrali, due porzioni intermedie e la porzione apicale, la quale prenderà contatto con la subunità GroES a sua volta costituita da una sorta di complesso che forma un cappuccio che va a chiudere la struttura. Le due porzioni cis e trans non si troveranno mai nella stessa configurazione durante tutto il processo se è legata l’ATP non può sussistere contemporaneamente il legame con l’ADP. La camera ha comunque una determinata e limitata dimensione,ma nonostante ciò si è visto che riesce ad accogliere catene polipeptidiche anche molto lunghe.
        
        Meccanismo
        
        Partiamo dalla condizione in cui la catena viene presentata dal complesso Hsp70-Hsp40 alla porzione cis di GroEL che è libera, l’interazione induce GroEL ad un cambio conformazionale che determina il richiamo dell’ATP, di cui se ne legherà una per ciascuna subunità di GroEL (GroEL ha 7 subunità e dunque avrà legato a se 7 ATP. L’attività della chaperonina risulta essere dunque più dispendiosa di quella di Hsp70). Il legame dell’ATP ha come conseguenza un cambio conformazionale tale da consentire lo stretching della catena polipeptidica sulla porzione cis di GroEL ed il riconoscimento di GroES con evidente chiusura della struttura, ma sull’altro versante determina la liberazione di GroES e dell’ATP: è un meccanismo a due pistoni, in cui se l’ATP e GroES sono legati ad un versante, non potranno essere contemporaneamente presenti sul versante opposto. La chiusura della struttura con GroES implica l’azione dell’attività ATPasica che idrolizza l’ATP ad ADP, e contemporaneamente la catena sta facendo i suoi tentativi di folding all’interno della camera. Questi tentativi vengono svolti in quanto le pareti polari della camera del folding servono affinché la catena polipeptidica, in questo ambiente idrofilico (con cariche nette negative), possa trovare quella forza che serve per formare il core idrofobico e precipitare in esso.
        Nel momento in cui avviene l’idrolisi dell’ATP,la struttura non è più stabile e viene persa l’affinità per GroES e si ha la fuoriuscita della catena polipeptidica sottoforma della configurazione nativa oppure in uno stato non correttamente foldato. A seconda di quanto è incompleto il folding della proteina, può essere preso incarico dall’Hsp70 oppure rientrare nuovamente nella chaperonina dal versante opposto.