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PROCESSI DEGRADATIVI (Autofagia (Markers autofagici (LC3 (è una proteina…

- - - - processo che consente di racchiudere organuli circondati da membrana e avviati alla degradazione.
    - - s’intende la possibilità di endocitare direttamente piccole porzioni del citoplasma o proteine all’interno della struttura del lisosoma. Non c’è la formazione di strutture racchiuse da membrana.
  - - - è una proteina importantissima perché consente la formazione del fagoforo, partecipa alla formazione della membrana dentro cui verranno racchiuse le proteine che devono essere avviate alla degradazione ed è indice di un processo autofagico che sta partendo. quando viene attivata in senso autofagico, subisce un taglio proteolitico (diventa LC3-2) e successivamente un subisce un processo noto come lipidazione. In questo modo viene associata alla membrana e cosi in qualche modo partecipa alla formazione del fagoforo e dunque a racchiudere ciò che deve essere degradato.
    - - Tuttavia ci sono dei processi che vanno avanti in maniera beclina indipendente pertanto come marker del processo autofagico non è del tutto affidabile.
        Il mancato aumento della beclina non sta ad indicare che non c’è un processo autofagico bensì potrebbe esserci un processo autofagico beclina indipendente.
    - - svolge un ruolo fondamentale nel processo autofagico ed è un marker dell’autofagia (primo ruolo). È la proteina accompagnatrice delle proteine poliubiquitinate o monoubiquitinate in K63 (secondo ruolo) e le accompagna alla degradazione, in particolare le accompagna all’autofagolisosoma. Si osserva un aumento della sua concentrazione all’inizio del processo autofagico e poi una diminuizione della sua concentrazione in quanto essa stessa viene degradata insieme alla proteina che viene avviata alla degradazione. Dunque, se attivo il processo autofagico, la concentrazione di P62 incrementa (per Western) per poi diminuire. Si osserverà un grafico a campana in condizione di processo autofagico normale. Si può osservare delle volte che la concentrazione di P62 incrementa, ma successivamente non diminuisce, questo indica che il processo autofagico è partito, c’è, ma per qualche motivo non si è potuto realizzare. Allora, l’AUTOFAGIA e il sistema UPS si possono considerare come processi che si controllano l’un l’altro e sono LE MACCHINE PROTEOLITICHE DELLA CELLULA. L’autofagia (controllata e mirata) può essere considerata come quel sistema che compensa il sistema UPS nel momento in cui quest’ultimo non ce la fa a degradare tutto. I 2 percorsi camminano e sono regolati in maniera parallela.
- - - - Come è fatto?
        
        20 S
        
        è costituito da un core proteolitico vero e proprio, detto core 20S costituito da quattro anelli ciascuno formato da monomeri dello stesso tipo. Gli anelli sono organizzati in modo α-β-β-α, quindi ciascun anello è costituito da un unico tipo di subunità ripetuta 7-8 volte. I monomeri α nei due anelli periferici e le subunità β nei due anelli nella porzione centrale. Questo è il core proteolitico 20S ed è l’unica struttura proteosomale che noi abbiamo a livello batterico. all’interno di questa struttura ci stanno le attività proteolitiche che comprendono solo tre attività enzimatiche che stanno soltanto in tre delle subunità β, ovvero nelle subunità β1 β2 e β5. β1 è un’attività proteolitica caspasi-like,cioè riconosce gli stessi punti dove vanno a tagliare le caspasi. L’acronimo caspasi significa che c sta per cisteina, perché sono degli enzimi a cisteina, cioè nel sito attivo viene usata la cisteina. Asp sta per aspartico perché riconoscono uno specifico acido aspartico in una sequenza come sito di taglio della proteina. Quindi le subunità sono β1 che attiva gli AA acidi e i piccoli AA idrofobici, con attività caspasi like, β2 è tripsina like mentre β5 è chimotripsina like. queste attività enzimatiche funzionano in maniera cooperativa. gli inibitori del proteosoma sono dei chemioterapici usati in terapia. Alcuni inibitori del proteosoma sono inibitori soltanto di una di queste attività. Non sono inibitori in grado di andare a bloccare tutte le attività. Basta solo che ne venga inibita una di queste subunità perché tutto il sistema, cioè tutto il 20S blocca l’attività degradativa, quindi l’inibizione su quella subunità si trasferisce alle altre subunità (concetto di regolatore allosterico). l’altra peculiarità del proteosoma è che nell’organizzazione di queste attività ci sono delle treonine che sono strategiche perché il 20S possa svolgere la sua funzione.
        
        19 S
        
        Man mano che andiamo verso gli organismi superiori il 20S acquisisce complessità. Questa complessità sta nel fatto che acquisisce una o due porzioni regolative che sono le 19 S (si forma il 26S). A loro volta anche queste sono costituite da anelli organizzati in multisubunità. il 19S svolge la funzione di riconoscimento quindi riconosce il substrato che deve entrare all’interno del proteosoma, ma non riconosce il substrato, riconosce la catena di poliubiquitina legata alla catena polipeptidica.Svolge inoltre l’attività di distacco della catena di poliubiquitina perché la proteina deve essere de poliubiquitinata. la proteina che viene poliubiquitinata è ancora una proteina quindi con una struttura tridimensionale che non entra dentro il proteosoma. Per questo come terza attività fondamentale vi è che, utilizzando l’energia di idrolisi dell’ATP grazie a subunità che hanno attività ATPasiche, la proteina viene defoldata, cioè la proteina viene riportata a catena polipeptidica in maniera tale che possa più facilmente entrare. l’altra funzione del 19S è quella di aprire l’anello α perché in qualche modo il primo anello dove c’è il 19S che ha riconosciuto la catena polipeptidica che deve degradare questo anello tende ad essere chiuso, però per poter far entrare la catena, quindi quando il sistema si attiva alcune delle subunità 19S riescono in qualche modo, probabilmente sempre utilizzando l’energia di idrolisi di altre subunità ATPasi, ad aprire questo anello, cioè le subunità subiscono delle modifiche conformazionali tali che si crea quell’apertura dentro cui può essere richiamata la catena polipeptidica. . Il passaggio successivo sarà: lo svolgimento della struttura nella catena polipeptidica ,l’apertura dei ring α da parte del complesso 19S , l’entrata della catena polipeptidica e l’uscita sotto forma di peptidi. In genere i peptidi sono tra 7 e 12 residui amminoacidici che troveranno delle eso- e endopeptidasi, che le riduranno ad amminoacidi liberi. La catena di poliubiquitina subisce l’azione associata di enzimi deubiquitinanti e idrolasi ,che staccano i singoli monomeri di ubiquitina. Questo è fondamentale perché i singoli monomeri di ubiquitina servono per ristabilire il pool di ubiquitina libera, che ritorna nuovamente disponibile per ubiquitinare altre proteine indirizzate alla degradazione.Inoltre Con l’attività ATPASICA può andare a gestire il reclutamento di enzimi deputati alle modifiche post traduzionali che avvengono sulle componenti della macchina della trascrizione.
    - - è una modifica particolare perché tutte le altre modifiche post- traduzionali tranne quelle che riguardano l’ubiquitin like protein sono aggiunte di gruppi, fosfato, metile, acetile, l’ADP ribosio ecc…, questa invece è una modifica di una proteina legando non un gruppo ma un’altra piccola proteina. l’ubiquitina è una piccola proteina di 76 AA della quale quelli fondamentali sono la glicina 76, cioè l’ultimo AA della catena al C-terminale e le lisine variamente distribuite tra cui quelle in posizione 11, 63 e 48 (importanti).
        
        Meccanismo
        
        Il processo dell’ubiquitinazione vede , inizialmente, l’attivazione dell’ubiquitina . L’ubiquitina è una proteina costitutiva della cellula per cui ha una concentrazione più o meno fissa nella cellula, quindi ci deve avere sempre un certo pool di ubiquitina libera per poter mandare avanti la reazione. se noi dobbiamo legare una proteina ad un’altra proteina abbiamo bisogno di energia.
        Da dove viene questa energia che poi consentirà il legame? L’attivazione dell’ubiquitina avviene per formazione di un legame tioestereo tra il gruppo –SH di una cisteina che si trova nel sito attivo dell’enzima E1 e il gruppo carbossilico COO- della Glicina 76. questo legame tioestereo è un legame che ha un ΔG di energia molto alto infatti la reazione procede con un consumo di una molecola di ATP rilasciata come AMP +2 fosfati inorganici. ). A questo punto l’ubiquitina ,che viene così attivata con questo legame ad alta energia, viene trasferita dall’enzima E1 all’enzima E2. Quindi l’enzima E1 serve solo per attivare, poi l’ubiquitina con il suo pacchetto energetico viene trasferita su un residuo di cisteina del sito attivo dell’E2 .A questo punto il passaggio successivo sarà l’ubiquitinazione del substrato che viene presentato da E3. E3 ha il compito di riconoscere il substrato da ubiquitinare e di posizionare il substrato in maniera tale che presenti correttamente una lisina accettrice di questa ubiquitina. L’ubiquitina attivata si andrà a legare su una lisina attraverso un legame ISOPEPTIDICO tra il gruppo NH2 presente nella catena laterale della lisina e il gruppo carbossilico COO- della glicina . Proprio per formazione di tale legame isopeptidico ad alta energia serve l’energia di idrolisi dell’ATP . Una volta che si è formato il primo legame isopeptidico la proteina target è monoubiquitinata, quindi il complesso cambia l’E2 perché il primo E2 ,che ha ceduto la sua ubiquitina attivata ,non è più ubiquitinato. Entra un nuovo E2 con una nuova ubiquitina legata e a questo punto l’ubiquitina verrà legata all’ubiquitina precedente a livello della lisina 48. le K48 sono le lisine della ubiquitina e non la lisina del target. La posizione 48 riguarda la lisina disponibile per la poliubiquitinazione. Quando portiamo avanti questa poliubiquitinazione e arriviamo almeno a più di 4 ubiquitine ,questa catena sarà quella riconosciuta e presentata al proteasoma. il numero di isoforme degli enzimi E1, E2 ed E3 a partire dagli organismi inferiori ,come il lievito ,fino all’uomo che :
        Ci sono poche isoforme di E1 addirittura solo 1 nel lievito,mentre appena 10 nell’uomo
        Relativamente piccolo è anche il numero di isoforme per quanto concerne a E2
        I complessi di E3 sono i più rappresentati ( non parliamo di singoli enzimi , ma di complessi di E3) perché sono questi che devono saper discriminare tra le proteine e sono di fatto in qualche modo i recettori regolativi di questo evento.
        
        Possiamo classificare le E3 ligasi in 3 gruppi
        
        Quelli con dominio HECT che possiedono una cisteina: - l’E2 con l’ubiquitina si lega al complesso E3; l' E3 si carica dell’ubiquitina; successivamente averrà l’ubiquitinazione sul substrato.
        
        E3 ring detti così perché hanno un dominio ring: l’E3 non forma il legame ma va a formare quel complesso che presenterà e posizionerà il substrato all’E2 in maniera tale che il substrato possa esporre la lisina che deve essere ubiquitinata da E2. In questo caso il legame viene formato da E2 mentre E3 ring serve per presentare il substrato e per mettere la lisina del substrato nella posizione giusta affinchè possa essere ubiquitinata.
        
        complessi di E3ligasi in cui variano le proteina adattatrici. hanno E2+ E3 + tutte le proteine adattatrici
        
        APC complex (complesso dell'anafase)
        
        il fattore von HIppel-Lindau. Questo complesso ha come substrato altamente specifico il fattore HIF che è il fattore inducibile indotto dall’ipossia. HIF viene attivato per riduzione dell’O2. Il fattore von Hippel-Lindau è importantissimo come tumor suppressor ,che troviamo alterato in diverse forme tumorali. HIF, fattore indotto dall’ipossia, è un fattore trascrizionale che si attiva nel momento in cui la cellula va in ipossia e trascrive geni coinvolti in due eventi fondamentali sia per le cellule in ipossia transiente ma ancor di più in cellule tumorali. L’ HIF da una parte determina l’attivazione della glicolisi, perché, se manca l’O2 ,un’attivazione della via glicolitica anaerobica favorisce la produzione di ATP in maniera ossigeno indipendente.Da questo punto di vista HIF essendo un fattore trascrizionale ha come suoi target i geni che codificano per gli enzimi della glicolisi. altro grande importante gene substrato di HIF è il gene che codifica VEGF (fattore di crescita endoteliale vascolare) cioè quel fattore che favorisce la formazione dei nuovi vasi. per cui la cellula tumorale è libera ulteriormente di fare ciò che vuole. HIF è uno di quei fattori che la cellula deve avere indipendentemente dal fatto che la cellula lo debba utilizzare o meno. L’HIF viene costantemente sintetizzato ma nel momento in cui siamo in presenza di ossigeno l’HIF è uno di quei fattori che subisce un‘IDROSSILAZIONE in prolina a scopo regolativo.La prolina idrossilata è una modifica post-traduzionale a significato strutturale; infatti l’idrossiprolina si trova nella proteina strutturale del collagene. Nell’HIF l’idrossilazione in prolina ha uno scopo regolativo:
        
        se c’è l’ossigeno la prolina viene idrossilata secondo un meccanismo dell’idrossilazione che ha come substrato l’ossigeno molecolare. L’ossigeno molecolare viene scisso in due atomi dalla monoossigenasi, un’atomo di ossigeno andrà a far parte del gruppo OH che verrà aggiunto alla prolina l’altro atomo di ossigeno se ne va sotto forma di acqua. L’idrossilazione in prolina (che avviene se c’è ossigeno) è quel segnale/modifica che permette all’HIF di essere riconosciuta dal fattore von Hippel-Lindau (VHL), quindi è un meccanismo di regolazione. Una volta che HIF viene riconosciuto da VHL,che è un’E3 ligasi, viene poliubiquitinato e degradato perché in quel momento HIF non serve perché c’è l’ossigeno. Dunque l’idrossilazione in prolina monitora la quantità di ossigeno che la cellula ha.
        
        Al contrario se l’ossigeno viene a mancare, l’HIF non potrà essere idrossilato. Se HIF non viene idrossilato non verrà riconosciuto dall’E3 ligasi ,per cui HIF si accumula e transita nel nucleo dove andrà ad attivare la trascrizione dei geni (per es. della glicolisi) necessari per superare questo momento di stress ipossico.
        
        SCF complex (contengono la cullina e la proteina adattatrice F-BOX)
    - - La proteina viene riconosciuta attraverso la catena di poliubiquitina in K48
        
        Il proteasoma 26S, macchina degradativa della cellula , riconosce sicuramente le ubiquitine in K48 ,ma può riconoscere anche altre poliubiquitine in altre K63. più di recente è stato visto che le K63 indirizzano alla degradazione autofagica e non a quella proteasoma dipendente. Se andiamo ad analizzare la struttura tridimensionale di una catena in K48 e in K63 ,vediamo che stericamente sono differenti; la catena in K48 ha un’organizzazione spaziale differente da quella in K63.Questo comporta differenze nel riconoscimento da parte del sistema lisosomiale, quindi autofagia, o del sistema proteasomale.
      - La proteina viene presentata al proteosoma attraverso un adattatore
        
        ci sono una serie di proteine che all’interno della loro mega catena polipeptidiche presentano una certa regione ovvero un UBP (dominio che lega l’ubiquitina ) può riconoscere l’ubiquitina con la struttura tridimensionale costituita dai suoi 76 amminoacidi o può riconoscere quella stessa struttura di 76 amminoacidi organizzati spazialmente nello stesso modo inserita all’interno di una proteina molto più lunga. Quindi quella proteina avrà un UBL ubiquitine-like domain ,cioè un dominio simile all’ubiquitina. Tra le proteine adattatrici troviamo: il fattore von Hippel-Lindau, parkina, CHIP (riconosce Hsp70 associata alla proteina misfolding) e Bag1 (opera una poliubiquitinazione in k27 che sarà riconosciuta da una specifica subunità 19S
      - Perché una proteina ,che un attimo prima nella cellula era attiva e funzionale, l’attimo dopo andrà incontro a degradazione?
        
        il sistema delle E3 ligasi riconosce una specifica regione detta degrone . Il degrone è una sequenza segnale per la degradazione cioè quella sequenza segnale che, in qualche modo ,viene riconosciuta dalla E3 ligasi. generalmente si trova nelle vicinanze della lisina substrato dell’ubiquitinazione. Il degrone è una sequenza che si trova nella struttura primaria ,sarà poi organizzata nella struttura terziara e sarà sempre presente nella proteina.
        
        Proteine misfolding
        
        se la proteina per es. ha subito un processo di ossidazione e risulta una proteina misfolded, ad un certo punto nel suo misfolding esporrà il degrone ,che sarà libero e visibile per essere riconosciuto.
        
        Proteine perfettamente foldate
        
        il degrone prima è nascosto e poi è reso visibile per modifiche post-traduzionali che possono modulare e modificare regionalmente la proteina in maniera tale che questa un attimo prima non espone il degrone e un attimo dopo si. il concetto del “timer”: nelle proteine fisiologiche, che hanno una vita media e dopo questa vita media più o meno lunga (minuti , ore, giorni) devono essere avviate a degradazione, tutto questo deve essere gestito dall’attività combinatoriale tra modifiche post-traduzionali ed esposizione del degrone.
        
        Il degrone viene esposto attraverso la regola dell'N-terminale. nella porzione iniziale della proteina, esistono degli amminoacidi che hanno azione destabilizzante. Sono piccole sequenze di residui idrofobici (che sono residui destabilizzanti). o residui basici. Nei procarioti il meccanismo consiste nel fatto che l’esposizione e quindi l’accessibilità a questi residui amminoacidici destabilizzanti consentono a questa catena polipeptidica di essere riconosciuta da una proteina adattatrice (ClpS), che la presenterà al 20S. Negli eucarioti è valida la stessa cosa con la differenza che in questo caso la regola dell’N-terminale consente il riconoscimento da parte dell’E3 ligasi.
    - - NF-kB è uno dei più importanti fattori che interviene nell’infiammazione, ma può svolgere ruoli anche nella proliferazione cellulare. Di fatto è un fattore pro-sopravvivenza coinvolto nei processi infiammatori ,ma in base a come si combina può svolgere ruoli anche nella morte. NF-kB è un fattore trascrizionale costituito da un dimero formato da due subunità p50 e p65. NF-kB deve essere attivato e controllato.La sua attività viene inizialmente controllata per compartimentazione:NF-kB è citosolica per cui la sua attivazione coinvolge un meccanismo che la porterà a traslocare nel nucleo dove svolge il suo ruolo di attivatore trascrizionale. Nel citosol NF-kB è sequestrata dal suo inibitore IKBα. Come si libera e quando si libera NF-kB dal suo inibitore? NF-kB si libererà nel mommento in cui il suo inibitore IKBα viene poliubiquinato in seguito a una serie di eventi, si stacca e viene avviato alla degradazione. Uno dei momenti di attivazione di NF-kB si ha quando IKBα viene degradato in maniera ubiquitina-proteasoma-dipendente. Chi gestisce se IKBα deve essere avviato alla degradazione? Questo dipende dallo stato di fosforilazione di IKBα. Se IKBα è defosforilato tiene legato NF-kB. La fosforilazione di IKBα gli fa esporre il degrone , che verrà riconosciuto dall’E3 ligasi che la ubiquitina per avviarla alla degradazione proteasoma dipendente. Il momento regolativo quindi non sta tanto in IKBα, ma a monte nella chinasi IKK che fosforila IKBα. La chinasi IKK viene a sua volta controllata e sequestrata da Nemo.il proteosoma interviene anche ad un altro livello dell’attivazione di NF-kB perché la subunità p65 di NF-kB non nasce come p65 ma come porzione più lunga p105. L’attivazione in questo caso avviene per tagli proteolitici da p105 a p65 gestiti dal proteasoma. In questo caso il proteasoma riconosce p105 e in qualche modo (ancora non si sa come )attiva la degradazione di p105 operando dei tagli sequenziali che degradano p105 parzialmente fino ad arrivare a p65 (p65 è la sua forma attiva). In questo caso l’attivazione di NF-kB è un’attivazione proteasoma-dipendente , ma che esula dal funzionamento del proteasoma come macchina degradativa della proteina. Il proteasoma in questo caso funziona come macchina della proteolisi controllata perché taglia quel pezzo in più della proteina e non determina la normale proteasi. L’attivazione di Nf-kB è un percorso che utilizza il proteosoma con due modalità diverse:
        -proteasoma come macchina di degradazione dello specifico inibitore IKBα, che viene ubiquitinato e completamente degradato.
        -proteasoma come sistema attivatore di una proteina per taglio proteolitico o ,per meglio dire , per tagli proteolitici perché ,come abbiamo detto prima, nel caso di proteine molto grandi il proteasoma non taglia direttamente , ma entra una parte per volta e il resto resta fuori.