Pasos:
A. Obtener la secuencia a analizar
B. Cortar el ADN (vector y objetivo), con la(s) misma(s) enzima(s) de restricción.
C. Unir el gen al ADN del vector por medio de la ligasa (la selección del vector es por tamaño, etc.); gracias a terminaciones cohesivas.
D. Transformar a la bacteria huesped por medio de la introducción del plásmido (vector puede dar características como resistencia a antibioticos, brillo, producción de insulina, proteinas-->lactosa, etc.).
D1. Puede ocurrir gracias a electroporación, cambio drásticos de temperatura choque
químico.
D2. Se necesita de un vector pequeño con pocos genes y pequeño(plásmidos o vitus),
de tal manera que pueda utilizar por su cuenta la maquinaria de replicación.
Vectores importantes para la amplificación pUC18, 19 o plásmido 101.
En la alpha complementación
Bacterias con plásmido (pUC 18 o 19) recombinado con el gen para degradar la ampicilina, las bacterias transformadas son de color azul; mientras que si no se muestra un color (blanco), no se ha transformado.
En el caso positivo, X-Gal (un isomero de la galactosa--> 5-bromo-4-cloro-3-indoil-beta-d-galactopiranopiranosido), a partir del cual, se detecta la presencia de la beta-galactosidasa (enzima de la lactosa), la rompe y forma por una parte galactosa y por otra parte la x (Color indigo, por el 4-cloro-3-bromo-indigo)
Este sistema se explica por medio de un sitio de clonación multiple (MCS), en el cual vieron que al insertar secuencias en el peptido alfa, no producen enzimas funcionales e interrumpen la producción de una enzima (clonación positiva)
En el caso negativo, al insertarse un segmento dentro del operon de la LacZ, impide la producción de una proteína funcional, y por lo tanto no rompe el X-Gal y el color que muestra va a ser blanco. La mutación que ocurre después se la denomina: LacZ-delta-M15. Para transformar este plásmido nuevamente, es necesario introducir una secuencia llamada: alpha-peptido; y como resultado produce una enzima funcional.
Pero si no se logra la clonación, el peptido alfa se mantiene intacto y se logra producir una enzima funcional.
Consejos
- No te apresures. el proceso necesita de alrededor de 16 a 20 horas.
- Colocar en refrigeración, mejora y precipita el color de las colonias
- Hacer un buen control: por medio positivo de la beta-galactosidasa (colonias azules y con IPTG) y negativo de la clonación (plasmido sin inserto).
- X-gal es delicado, por lo que no es recomendable colocarlo en placas recién salidas del autoclave o en la luz del sol.
- Ten cuidado de los falsos positivos y negativos, pueden ser muy engañosos. En positivos, puede que sea cualquier fragmento, no el tuyo. Y el negativo, es aquel que aun cuando se inserta, puede mostrar una beta galactosidasa.
- Usar un plásmido (contenga la clonación adecuada pUC 18, 19, pGEM-T y pBluescript) y bacterias (E. coli-XL1-Blue, DH5alfa, DH10beta, JM109, JM110 y Top10) apropiadas para el experimento.
Una parte que hay que tomar en cuenta es que otros tipos de métodos se puede utilizar. Como por ejemplo insertar una secuencia que les permita sobrevivir en un medio hostil. O promoviendo a la letalidad de un gen al insertarlo en la bacteria se expresa.
Existen 6 partes: CAP, promotor, operador, LacZ (beta-galactosidasa), LacY (permeasa) y LacA (transacetilasa)
Un gen externo produce IPTG, un isomero no hidrolizable de la galactosa, que evita la unión del represor al operador por medio de su ligado a esta proteína. El represor es separado del templado por medio de la lactosa.
Si hay mas lactosa que glucosa, el CAP se activa por medio de la proteína del mismo nombre, para que de tal manera que optimice la lactosa y se la aproveche el compuesto