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LES PROTÉINES Structure tridimensionnelles des protéines (Structure…
LES PROTÉINES
Structure tridimensionnelles des protéines
Introduction
Les protéines fibreuses, à aspect filamenteux
Statiques
Constituent les tissus de soutien (ex : collagène)
Charpente des cellules, des organes (kératine : ongle, cheveux / collagène : tendons, peau, os, ivoire dentaire)
Peu soluble dans l'eau : dû à leur aspect fibreux
Protéines globulaires
Dynamique : biologiquement active pour la plupart localisées dans le cytosol, milieux extracellulaires, ou accolées (interne ou externe) ou intégrées dans la membrane
Donc plus ou moins soluble dans l'eau : les globulaires sont constitués de chaînes polypeptidiques denses et ramassées
Structure primaire - niveau 1
Définition
Séquence linéaire en AA : synthèse peptidique
Indépendante de la géométrie spatiale
localisation des ponts disulfures
Unique pour chaque protéines parfaitement définie parce génétiquement codé
......ADN -> ARNm -> séquence 1ère des protéines -> 3 autres structures
(transcription)
..
(traduction)
Intérêt du séquençage des protéines
Établir des homologies
Pour constituer des familles moléculaires
Récepteur membranaire = immunoglobulines
Facteurs de croissance = insuline
Comprendre l'évolution moléculaire des protéines apparentées
Arbre généalogiques du cytochrome cellulaires, de l'hémoglobine
Élucider les bases moléculaires de la fonction de la protéine
Les protéines ne varient peu ou pas au cours du temps
Détecter des modification sur un AA produisant des pathologies graves
Comment se déroule le séquençage des protéines, faites de polypeptides ?
Isoler le peptide
Purification complète
Évaluation masse molaire
Déterminer sa composition en acide aminé
Par analyse totale du polypeptide
Hydrolyse acide + HCL 6M sans O2 (24-72h)
Coupure de toutes les liaisons peptidiques
Asn et Gln converties en Asp et Glu
Trp complètement détruit, mais détecté après
Hydrolyse basique +NAOH 6M tous les résidus sauf Trp
Par analyse de l'hydrolysat
AA séparés et dosés au moyen d'automates
HPLC (chromatographie liquide à haute performance) : chromatographie d'échange d'ions)
AA détectés
Soit par fluorescence après dérivation préalable (cf Protéines les polypeptides)
Soit par coloration en présence de ninhydrine
Établir sa séquence, stratégie rigoureuse en 2 temps
Détacher un à un tous les AA et les identifier
Extrémité N-ter : plusieurs r actifs : FDNB, PTC, chlorure de dansyle
Extrémité C-ter : action de carboxypeptidases : plus difficile
Séquençage indirect par des outils de biologie moléculaire
=Détacher un à un tous les résidus AA
Voie enzymatique
Attaque l'extrémité de la chaîne (liaison coupée les unes après les autres / cinétique d'hydrolyse contrôlée = action continue)
Récolte, sépare et identifie (chromatographie des AA successivement détachés)
Exopeptidase / Carboxypeptidases / Aminopeptidase
Inconvénients :
Les enzymes s'éssouflent vite
Spécificité réduite
Affinité différente : vitesse de coupure variable
Avantages :
Les AA sont respecté
Spectrométrique de masse
Indentification par chromatographie d'échanges d'ions
Voie chimique
Méthode de SANGER
Arylation par un dérivée aromatique
Étape historique dans l'analyse de protéines (Prix nobel de chimie en 1958 puis en 1980)
Élucidation de la composition et de la séquence de la molécule d'insuline = 1ere molécule analysée
Méthode permettant de déterminer le résidu N-terminal sauf qu'il y a un inconvénient, c'est une méthode non récurrent
Dérivation par le chlorure de dansyle
Acylation
1 - diméthyl - amino -naphtalène - 5 - sulfanyle de meilleur qualité que le FDB, car il a une plus grande stabilité
Florescent : détection 100 plus sensible
Méthode permettant de déterminer le résidu N terminal
Méthode d'Edman
Carbamylation
Nouveau jalon dans l'histoire de l'analyse des protéines en 1950
AA N-terminal complexé au PTC (phényl isothiocyanate) détectable par UV et bien séparable
Méthode permettant de determiner le résidu N-terminal
Dégradation séquencielle
La chaîne restant n'est plus hydrolysée
AA N-terminal se détache, le reste du peptide non hydrolysé : nouvelle attaque possible
Dégradation récurrente, c'est une méthode automatisée dans les séquence actuelles couplé à des HPLC