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Identification of Diatraea spp. (Lepidoptera: Crambidae) based on…
Identification of
Diatraea spp
. (Lepidoptera:
Crambidae) based on cytochrome oxidase II
Materiales y métodos
:card_file_box:
:check:Extracción y amplificación de DNA
Se extrajo el DNA del abdomen de los machos con un kit QIAGEN
Se hizo una amplificación in vitro de los fragmentos de COII mediante PCR usando Taq polimerasa (PROMEGA) y primers usados en
Diatraea:
A-298, B-tLYS, M13 forward/A-298 y M13 reverse/BTLYS
A los productos de amplificación se les realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% y se les tiño con SYBR-Safe (invitrogen)
Los productos amplificados con primers A-
298/B-tLYS fueron usados para la metodología SSCP
:check:Detección de genitales
Los
Diatraea spp
masculinos se clasificaron preliminarmente y se realizó un analisis morfométrico asociado con los genitales
A su vez se analizó el polimorfismo utilizando conformación de una sola cadena (SSCP) específicamente un fragmento del citocromo oxidasa de la subunidad II del gen mitocondrial (COII)
:check:Muestra
-Se tomaron 4 especies las cuales se cultivaron de unas muestras tomadas del Valle del Cauca:
D. saccharalis, D. indigenella, D. tabernalla, D. busckella
-Otras 3 se tomaron de cultivos de caña de azúcar (Caquetá, Colombia):
D. centrella, D. albicrinella
, Individuos no descritos
Otro de cultivos (Cundinamarca, Colombia):
D. saccharalis
:check:Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
1 µL de producto de PPCR + 9 µL de tampón de muestra (Formamida al 95%), Tinción con azul de bromofenol.
Desnaturalización a 95°C por 5 min.
Baño de hielo
Genera un plegamiento de la hebra con ella misma. Cada hebra genera una conformación
Separación por electroforesis (gel de poliacrilamida 49:1) durante 4 horas a 600 V
Para evaluar la densidad de conformación de cada hebra
Tinción con Nitrato de Plata al 0,1% p/v (para visualizar)
:check:Análisis bioinformatico
Las secuencias del gen mitocondrial CO II se usaron para generar una filogenia y establecer las distancias evolutivas mediante utilizando Kimura-2-Parameter con 1000
:check:Análisis Morfométrico
Del lobulo lateral en el tegumen en los genitales masculinos de Diatraea. A.
Género
Diatraea
(Lepidoptera:
Crambidae
) son una de las principales plagas en América