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CELLULE STAMINALI (MESENCHIMALI (Differenze da quelle Embrionali (Prob.…

- - - - Cordone Ombelicale
      - Midollo Osseo
      - Tessuto Adiposo
    - - Condrociti
      - Osteoblasti
      - Adipociti
    - - SENESCENTI
  - - - Essendo che molto ricco di cellule stromali / cell del sangue / Adipociti
    - - Separazione delle cell mesenchimali ed ematopoietiche
      - separazione delle mononucleate da quelle adipose (lipidi concentrati ) e del sangue
      - opp si possono usare com'è senza pulizia
    - - le Emato = sospensione mentre le Mesenchimali = aderiscono alla superficie
      - il 73% usato con il siero quindi si usa DMEM con bassa glu all'interno
    - - Preparazione Master cell bank / A partire dalla working si fanno crescere in 2D o 3D
      - Uso di bioreattore Media Scala
        
        Spinner Flash / Wave
        
        Uso microcarrier gelatinose
  - - - Non danno ad Immunorigetto per questo sono usate sia autologhe che allogene.
    - - Possono essere usate sia come cell differenziate ma anche non differenziate
  - - - Derivano da un embrione
    - - Quindi non possono essere espanse
  - - - 1_ Crescita in condizioni Ipossiche
      - 3_ Rapamicina
      - 2_ Inibitori per Istone Acetil transferasi
        
        Immessi nel Medium che riducono la senescenza
      - 4_ Antiossidanti
        
        Ac.Ascorbico che previene
- - - - Selezionando quelle CD34+ (è un marker di selezione per cell stem ematopoiettiche )
      - In modo da isolare una frazione di cellule ricca di progenitori
      - oppure altro modo
        
        si labellano le cellule con un SOLO anticorpo (es contro CD34) che è legato a piccole particelle di ferro
        
        le cellule vengono trattate con un magnete in colonna in modo da intrappolare le cellule positive al marcatore in colonna grazie al magnete esterno. E tutte le altre cellule che non sono positive al marcatore contro cui l'anticorpo è disegnato fluiranno attraverso la colonna
    - - questo permette la selezione delle SIDE POPULATION
        
        state scoperte usando l'eccitazione ultravioletta basata sull'efflusso di Hoechst 33342 (Ho342)
  - - - VIVO
        
        Goden Standard
        
        Iniettandole in un topo immunodepresso
        
        VIVE = Le cell sono in grado di rinnovarsi in tutti i tipi di cell del midollo osseo = cell Emato
        
        Quindi non si hanno solo i progenitori delle cell del sangue ma vere cell stem ematopoietiche
        
        Chiamato LONG TERM Reconstitution
        
        Saggio per capire se la coltura è arricchita
        
        2_ Prelevo le cellule e le Inietto in un II Topo Immunodepresso
        
        1_ Inietto in un topo Immunodepresso (quando si è ristabilito)
        
        Se le cellule ripopolano entrambi i topi sono vere staminali altrimenti si trattava soltanto i progenitori il cui tempo di rinnovo finito
        
        Dosaggio CFU
        
        Veloce
        
        Prevede che le cell ematopoietiche stem siano cresciute nella milza e si aspetta fino ad avere colonie
        
        Permette di contare le colonie cresciute nella milza
      - VITRO
        
        Saggio CAFC
        
        le cellule resteranno in vita più a lungo, formando delle colonie con differenti morfologie
        
        LTC-IC (Long term culture initiating cell)
        
        I progenitori riescono a crescere fino a 7 settimane poi muoiono restano in vita solo stem (dopo la purificazione)
        
        PARAMETRI per la crescita in vitro
        
        densità d'inoculo
        
        non si deve diluire troppo (sono importanti le cell accessorie )
        
        il feeding
        
        pH
        
        soltanto cambiando il pH si ha la crescita delle cell progenitrci mieloidi(7.2 - 7.9) o progenitrici degli eritrociti (pH lievemente più basso )
        
        densità O2
        
        deve essere mantenuta bassa (ipossiche)
        
        Durata della coltura massimo 2 settimane (no>)
- - - - BIFASIC bioreacteur
        
        Quelle stromali crescono in un lato / quelle ematopoietiche dall'altro
- - - - Sono in grado di differenziare in altri tipi cellulari che non siano quello del tessuto dove sono collocate
    - - perchè in N° ridotto
    - - opp medicina rigenerativa es. cellule stem della pelle usate per ricostruire tessuti danneggiati
        
        opp cell stem mesenchimali (per riparare ossa cartilagini /oppure nel modulare il sist. immunitario, nelle pato autoimmuni
  - - - Etichettate in vivo e quindi possono essere rintracciate
      - Isolate / etichettate / trapiantate di nuovo nell'organismo per determinare cosa diventa
      - Isolate / Coltivate in vitro / Manipolate aggiungendo fattori di crescita o introducendo geni che aiutano a determinare
- - - - Midollo Osseo
        
        e si differenziano
        
        In tutti i TIPI di cell del sangue
      - Cordone Ombelicale
    - - danno origine a cellule
        
        Mieloidi
        
        neutrofili e Linfociti (Multipotenti )
        
        Linfoidi
        
        cell T e B
  - - - Queste condizioni permettono di mantenere la capacità di autorinnovo
      - è una delle cause che non permette Espansione in coltura senza strato di Stromali
    - - E dato da :
        
        Elementi Cellulari :
        
        cell Ematopoietiche
        
        STROMALI (reticolari / adipociti)
        
        Fattori di crescita
        
        TNFalfa / LIF / p21
        
        Matrice extracellulare
        
        Collagene e fibronectina