Génie Génétique

ADN

ARN

ACIDES NUCLEIQUES

Obtention de l'ADN

Le + fréquent/facile : sang total recueilli sur anticoagulant (EDTA, chélateur des ions Ca2+) => Seuls les GB possèdent de l'ADN

sang total recueilli sur héparine (seulement pour lymphocytes)

Matériel biologique pour l'obtention de L'ARN

  • Culture cellulaire - Tissu fraîchement isolé (< 15min) - Tissu congelé en azote liquide 80°c

Précaution pour la manipulation de l'ARN

présence de nucléases (RNASE) => manipulation à 4°c

Extraction ADN Génomique

Plusieurs techniques et des points communs

Précipitation des protéines

Précipitation de l'ADN

Lyse des membranes Cellulaires

GOLD STANDARD PHENOL/CHLOROFORME

Extraction à l'isopropanol et saline, la colonne d'affinité composée de silice et la chromatographie échangeuse d'anions

La majorité de l'ARN est dans le cytosol

on lyse les membranes cellulaires en présence de chels chaotropiques ce qui permet d'inhiber les ribonucléases

on précipite les protéines avec du phénol acide (pH<5)

Colonne porte une résine chargée positivement (DEAE)

elle retient l'ADN qui est chargée négativement par ses groupements phosphates

on récupère PEU d'ADN

quantification de l'ADN génomique ou de l'ARN total

Qualification de l'ADN génomique ou de l'ARN total

Les acides nucléiques absorbent avec un pic maximum à 260nm et les protéines à 280nm

le rapport A260/A280 permet d'évaluer la contamination protéique

A260/A230 permet d'évaluer la contamination organique

1.8 et dans l'idéal égal 2

par mesure de la densité optique d'une solution d'acides nucléiques à 260nm (spectrophotomètre)
BEER LAMBERT