Génie Génétique
ADN
ARN
ACIDES NUCLEIQUES
Obtention de l'ADN
Le + fréquent/facile : sang total recueilli sur anticoagulant (EDTA, chélateur des ions Ca2+) => Seuls les GB possèdent de l'ADN
sang total recueilli sur héparine (seulement pour lymphocytes)
Matériel biologique pour l'obtention de L'ARN
- Culture cellulaire - Tissu fraîchement isolé (< 15min) - Tissu congelé en azote liquide 80°c
Précaution pour la manipulation de l'ARN
présence de nucléases (RNASE) => manipulation à 4°c
Extraction ADN Génomique
Plusieurs techniques et des points communs
Précipitation des protéines
Précipitation de l'ADN
Lyse des membranes Cellulaires
GOLD STANDARD PHENOL/CHLOROFORME
Extraction à l'isopropanol et saline, la colonne d'affinité composée de silice et la chromatographie échangeuse d'anions
La majorité de l'ARN est dans le cytosol
on lyse les membranes cellulaires en présence de chels chaotropiques ce qui permet d'inhiber les ribonucléases
on précipite les protéines avec du phénol acide (pH<5)
Colonne porte une résine chargée positivement (DEAE)
elle retient l'ADN qui est chargée négativement par ses groupements phosphates
on récupère PEU d'ADN
quantification de l'ADN génomique ou de l'ARN total
Qualification de l'ADN génomique ou de l'ARN total
Les acides nucléiques absorbent avec un pic maximum à 260nm et les protéines à 280nm
le rapport A260/A280 permet d'évaluer la contamination protéique
A260/A230 permet d'évaluer la contamination organique
1.8 et dans l'idéal égal 2
par mesure de la densité optique d'une solution d'acides nucléiques à 260nm (spectrophotomètre)
BEER LAMBERT