Replikacja DNA, zebrał: dr inż. Adam Kuzdraliński
Cykl komórkowy - to uporządkowany ciąg zdarzeń zachodzących w określonej kolejności podczas życia komórki. Na cykl ten składają się podział komórki i okres między podziałami. Źródło
Miejsce replikacji w cyklu komórkowym
Okres między podziałowy w życiu komórki to tak zwana interfaza. Zajmuje znaczną część cyklu komórkowego i wyróżnia się w niej 3 stadia: (1) faza G1 - wysoka aktywność metaboliczna, wzrost komórki - komórka wykonuje zadania, do których została powołana, i przygotowuje się do skopiowania swojego materiału genetycznego, czyli replikacji DNA; (2) faza S (synteza) - replikacja DNA; faza trwająca najdłużej, stanowi zasadniczy etap przygotowań do kolejnego podziału. Kończy się gdy wszystkie chromosomy ulegną podwojeniu; (3) faza G2 - końcowe przygotowania do podziału; Z końcem fazy G2 rozpoczyna się podział komórki. Źródło
U człowieka trwa od 8 do 24 godzin – podział jądra (mitoza) zajmuje około
10% tego czasu. Źródło
Cechy replikacji
Istnieją trzy teoretyczne modele przebiegu procesu replikacji
semikonserwatywny, czyli replikacja półzachowawcza - nowopowstała podwójna helisa składa się z jednej nici nowodobudowanej i jednej pochodzącej z macierzystej cząsteczki; Źródło
konserwatywny - replikacja zachodzi bez rozplatania podwójnej helisy. Każda jej nić stanowi matrycę dla nowego DNA. Powstają dwie cząsteczki: nienaruszona macierzysta oraz potomna - w całości zbudowana z nowych nici; Źródło
przypadkowy - każda nić cząsteczki macierzystej ulega podziałowi, a powstałe w ten sposób fragmenty, przemieszane w cząsteczkach potomnych służą jako matryce dla nowych nici. Źródło
Trzy modele na obrazku: 
Źródło
W 1958 roku M. Meselson i F. Stahl wykazali prawdziwość semikonserwatywnego modelu replikacji. W swoich badaniach wykorzystali oni różnice w gęstości cząsteczek DNA syntetyzowanych przez bakterie hodowane na pożywkach zawierających różne izotopy azotu: 14N i cięższy 15N. Charakterystyczny układ pasków uzyskany po ich wirowaniu wykluczył możliwość występowania modelu przypadkowego i konserwatywnego. Źródło
Substratami do syntezy nowej nici są trifosfonukleotydy. Rozerwanie dwóch wysokoenergetycznych wiązań fosforanowych dostarcza energii potrzebnej do utworzenia wiązania estrowego między kwasem fosforowym a dezoksyrybozą. W ten sposób powstają również nukleotydy zawierające jedną grupę fosforanową i budujące cząsteczkę DNA. Ilość błędów popełnianych podczas replikacji jest bardzo mała, dzięki istnieniu specjalnych mechanizmów korekcyjnych, usuwających nieprawidłowe nukleotydy. Źródło
Replikacja rozpoczyna się w specjalnych obszarach zwanych miejscami inicjacji replikacji – ori (z ang. origin, czyli początek). Do nich to przyłączają się enzymy replikacyjne. U bakterii występuje tylko jedno takie miejsce, zaś u Eucaryota jest ich wiele. Źródło
Rozpoczęcie replikacji wymaga syntezy krótkich starterów RNA (1-60 nukleotydów), które później są usuwane i zastępowane odpowiednimi fragmentami DNA. Nowe odcinki DNA tworzone są w widełkach replikacyjnych, czyli miejscach w których macierzysta cząsteczka rozdwaja się na dwie nowe nici. Źródło
Replikacja jest dwukierunkowa – tzn. przebiega jednocześnie na dwóch niciach. Nowe łańcuchy syntetyzowane są zawsze w kierunku od 5’ do 3’. Wydłużanie nici wiodącej odbywa się w sposób ciągły, zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych. Nić opóźniona syntetyzowana jest w kierunku przeciwnym, w sposób nieciągły, poprzez łączenie fragmentów Okazaki. Źródło
Białka biorące udział w procesie replikacji tworzą wieloenzymatyczny aparat, który jest umiejscowiony w widełkach replikacyjnych - replisom Źródło
Helikaza - rozrywa wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA
Prymaza – syntetyzuje startery RNA
Polimeraza DNA – jest odpowiedzialna za poprawną syntezę nowych nici
Białka wiążące jednoniciowy DNA – przeciwdziałają ponownemu połączeniu się rozplecionych łańcuchów
Nukleaza DNA – usuwa startery
Ligaza DNA - łączy fragmenty Okazaki, katalizuje tworzenie się wiązania fosfodiestrowego między grupą 3’-OH, a grupą 5’-fosforanową. Proces ten wymaga nakładu energii, zgromadzonej głównie w ATP
Naprawcza polimeraza – dobudowuje DNA w miejscu usuniętych starterów.
Schemat procesu replikacji Źródło
Etapy
Inicjacja
Elongacja
Terminacja
Replikacja DNA rozpoczyna się w specyficznym miejscu cząsteczki DNA
zwanym miejscem inicjacji replikacji („ori” - ang, origin - początek) Źródło
Rozpoczęcie replikacji w miejscu ori wymaga syntezy krótkich odcinków RNA, tzw. starterów (1-60 nukleotydów), które są następnie usuwane i zastępowane odcinkami DNA Źródło
Jednostką replikacji jest replikon — stanowi on odcinek DNA zawierający miejsce inicjacji replikacji, oraz wszystkie sekwencje, które są pod jego kontrolą i replikują się wraz z nim. Źródło
Liczba miejsc inicjacji replikacji chromosomu waha się od jednego w przypadku nukleoidów bakteryjnych, do kilkuset u drożdży, a nawet kilkudziesięciu tysięcy u organizmów wielokomórkowych (liczba ori dla całego genomu), np.: w największym spośród czterech chromosomów Drosophila melanogaster liczącym 51 Mpz replikacja rozpoczyna się w ponad 6 tys. miejsc. Źródło
Regiony ori występują w odcinkach międzygenowych.
Źródło
Bakteryjne regiony oriC są zlokalizowane w bliskim sąsiedztwie genów kodujących białka zaangażowane w inicjację replikacji; z reguły przed 5' lub za 3' końcem genu dnaA Źródło
Replikon wszystkich dotychczas poznanych bakterii obejmuje cały chromosom — długość replikonu równa się długości chromosomu. Źródło
W chromosomach eukariontów i prawdopodobnie również niektórych archebakterii występuje wiele replikonów — ich długość waha się w granicach od kilkudziesięciu do kilkuset tysięcy par zasad Źródło
Liczba miejsc ori chromosomów komórek organizmów tkankowych ulega zmianie w zależności od fazy rozwoju np. w komórkach embrionalnych jest około 20 razy więcej miejsc inicjacji replikacji Źródło
Białka inicjujące replikację DNA wiążą się swoiście z sekwencjami umiejscowionymi w regionie ori i dlatego w literaturze anglojęzycznej oznacza się je często skrótem OBP (ang. origin binding proteins). Źródło
Rolę inicjatora replikacji chromosomu bakteryjnego pełni pojedyncze białko, DnaA Źródło
Rolę inicjatora replikacji u organizmów
eukariotycznych pełni kompleks sześciu białek ORC (ang. origin recognition complex). Źródło
Białka inicjatorowe przyłączając się do regionu ori powodują zmiany strukturalne DNA (m. in. zagięcie DNA), które w dalszych etapach inicjacji replikacji prowadzą do rozwinięcia podwójnej helisy DNA i utworzenia oczka replikacyjnego. Rozplatanie DNA jest wynikiem charakterystycznej dla regionu ori niestabilności helikalnej, dodatkowo zwiększonej po związaniu białek. Źródło
Polimeraza DNA działa w dwóch trybach – polimeryzacji (P) i edycji (E). Jeśli polimeraza wprowadzi błędny nukleotyd do nowej nici, zmienia się jej kształt i wchodzi w tryb edycji. Staje się wtedy 3’- 5’ egzonukleazą odcinając błędnie wprowadzony nykleotyd. Źródło
Z powodu antyrównoległego układu nici DNA i syntezy nowej nici odbywającej się w kierunku 5’>3’, widełki replikacyjne są asymetryczne, tzn. jedna nić jest syntetyzowane ciągle (nić wiodąca ang. leading strand), a druga (nić opóźniona, ang. lagging strand) - w kawałkach zwanych fragmentami Okazaki. Źródło
Polimeraza DNA nie jest w stanie rozpocząć syntezy komplementarnej nici od nowa. Może dobudowywać nowe nukleotydy do istniejącego już pasma DNA lub RNA sparowanego z matrycą. Początek syntezy nowej nici wymaga więc startera (ang. primer). Źródło
Sposób replikacji DNA na nici opóźnionej: Startery (ang. primers) złożone z RNA powstają co ok. 200 nukleotydów. Po wypełnieniu luk przez polimerazę DNA, startery są degradowane przez RNazę H. Polimeraza DNA znów zapełnia luki. Pasma DNA są scalone przez ligazę DNA. Źródło
Po rozdzieleniu komplementarnych pasm przez helikazę DNA powstają fragmenty jednoniciowego DNA wykazujące tendencję do tworzenia krótkich, dwuniciowych fragmentów o strukturze spinki do włosów. Stanowią one przeszkodę dla polimerazy. Problem likwiduje białko wiążące jednoniciowy DNA (ang. single strand binding protein - SSB), wiążące jednoniciowe fragmenty w sposób umożliwiający polimerazie syntezą nowego łańcucha. Źródło
Topoizomerazy zapobiegają zaplątaniu się DNA w trakcie replikacji i rozdziału chromosomów do komórek potomnych. Rozplatanie nici DNA przez helikazę generuje tzw. skręceniowe naprężenie – gdy jest ono bardzo duże uniemożliwia dalsze rozplatanie. Źródło
Prokaryotic Okazaki fragments are longer, with the typical length observed in Escherichia coli (E. coli) being about 1000 to 2000 nucleotides. Źródło
The length of eukaryotic Okazaki fragments ranges between 100 and 200 nucleotides. Although comparatively shorter, they are produced at a rate slower than that observed in prokaryotes. Źródło
U prokariontów replikacja kończy się w miejscu występowania specyficznej sekwencji
„ter” Źródło
U eukariontów replikacja ulega zakończeniu w miejscu zetknięcia się widełek
replikacyjnych przebiegających w przeciwnych kierunkach Źródło
The eukaryotic DNA replication is characterized by a unique end-replication problem, wherein a part of DNA present at the ends of the chromosome does not get replicated. So, the lagging strand is shorter than the leading strand. This problem is addressed in eukaryotes by the presence of non-coding, repetitive DNA sequence called telomeres, at the ends of chromosomes. Źródło
Aktywacja telomerazy związana jest z unieśmiertelnianiem komórek nowotworowych Źródło
proces replikacji kończy usunięcie starterów (za pomocą endonukleazy) i zastąpienie ich
komplementarnymi fragmentami DNA Źródło
Materiały video
Jeśli chodzi o (...) enzymy bakteryjne, wśród nich wyróżniamy trzy typy polimeraz. Zwana inaczej cząsteczką Kornberga polimeraza DNA I ma za zadanie przede wszystkim ochronę łańcucha DNA przed wbudowaniem nieodpowiedniego nukleotydu, co mogłoby skutkować mutacją genetyczną. Polimeraza DNA II zaangażowana jest zarówno w kontrolę nad prawidłowością procesu replikacji, ale i uczestniczy w naprawie uszkodzonego materiału genetycznego. Polimeraza DNA III to cząsteczka będąca przede wszystkim głównym inicjatorem procesu powielania DNA, odpowiadając szczególnie za tworzenie replisomu niezbędnego do rozpoczęcia syntezy łańcucha polinukleotydowego. Źródło
Polimerazy eukariotyczne są nieco bardziej skomplikowane. Wyróżniamy tu polimerazę DNA alfa, beta, delta oraz epsilon. Polimeraza DNA alfa pełni główną rolę w procesie replikacji materiału genetycznego i najaktywniejsza jest w fazie S cyklu komórkowego. Niejako jej przeciwieństwo stanowi polimeraza DNA beta – enzym najmniej czynny podczas fazy S. Polimerazę DNA delta uznaje się za odpowiednik polimerazy DNA III bakteryjnej, odpowiadać więc będzie za inicjację replikacji, natomiast polimeraza epsilon zaangażowana jest głównie w kontrolę prawidłowości procesu oraz naprawę materiału genetycznego. Źródło
Telomery (gr. telos – koniec i meros – część) są to nie kodujące, powtarzające się motywy nukleotydowe, które chronią zakończenia prawidłowych chromosomów przed degradacją i fuzją, co zapewnia utrzymanie stabilności genomu. U człowieka powtarzającym się motywem jest sekwencja TTAGGG (1, 2). Telomery pełnią szereg istotnych funkcji m.in.: chronią chromosomy przed rekombinacją, zapobiegają powstawaniu chromosomów dicentrycznych, umożliwiają systemom naprawczym rozpoznanie prawidłowych i uszkodzonych zakończeń chromosomów, zapewniają przestrzenną organizację jądra komórkowego oraz regulację ekspresji genów zlokalizowanych w pobliżu telomerów. Ponadto, zapobiegają translokacjom, amplifikacjom i delecjom materiału genetycznego (2–4). Każdy podział komórki związany jest z nieodwracalnym skracaniem sekwencji telomerowej (ok. 50–150 pz). W wyniku podziałów komórki i replikacji DNA dochodzi do skracania długości telomerów oraz aktywacji szlaków procesów związanych ze starzeniem komórki, w tym również indukcji apoptozy (5, 6). Enzymem odpowiedzialnym za utrzymanie odpowiedniej długości telomerów jest telomeraza (1, 5, 6). Enzym ten, o masie 500 kDa, odgrywa szczególną rolę w procesie proliferacji komórki. Telomeraza jest polimerazą DNA zależną od RNA, która syntetyzuje telomery na zasadzie odwrotnej transkrypcji (specyficzna odwrotna transkryptaza). Składa się z fragmentu nici RNA (hTERC/hTR) oraz podjednostki białkowej o aktywności odwrotnej transkryptazy (hTERT). Źródło