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10.2. GENÉTICA FORENSE - VANRELL (EM SÍNTESE: (Dependendo da quantidade e…
10.2. GENÉTICA FORENSE - VANRELL
DNA:
Suas características são únicas para cada indivíduo, EXCEÇÃO - gêmeos IDÊNTICOS ou UNIVITELINOS.
Podem ter impressões digitais DIFERENTES - por fenômenos intra-uterinos.
Os POLIMORFISMOS presente na molécula de DNA não mudam, permanecem por toda vida.
É o DNA que tem mais chance de sobrevivência - mesmo que a odontologia tenha polimorfismos resistentes como os dentes-
Qualquer resto orgânico-fragmento ósseo-EXCETO, carbonizados ou que sofreram imersão prolongada em ÁGUA SALGADA.
Molécula do DNA
*
:
DNA Nuclear:
Bases Nitrogenadas
PCT-decorar
PIRIMIDINAS:
Citosina
Timina
possui mais Hidrogênio-é a diferença das duas.
Ácidos Nucleicos
Bases nitrogenadas
GAP-decorar
PURINASx
Guanina
Adenina
Entre as
bases púricas e pirimidínicas
- estabelecem
pontes de hidrogênio.
RNA - Filamento único
DNA - NÃO
DNA mitocondrial
foto livro
Estabilidade do DNA:
Possui enorme estabilidade.
Múmias egípcias
Insetos
Restos de esqueletos antigos podem dar boas sequências de DNA mitocondrial.
Polimorfismo do DNA:
É em essência a pesquisa da própria identidade de um indivíduo.
Detecção dos RFLPs:
A capacidade para diferenciar indivíduos foi descrita 1980
Essa técnica usa o processo de mapeamento de
SOUTHERN
para detecção dos fragmentos de DNA usando
oligonucleotídeos
marcadores com radioisótopos, e que serão as sondas (probes) capazes de reconhecer um par entre milhares de fragmentos de DNA.
Observando séries de diferentes locações (loci) de VNTRs, pode se traçar o perfil do indivíduo.
achados na cena do crime mais perfil do suspeito - apresentando concordância em 4 ou mais desses loci de VNTR, permite a identificação do agente.
Técnica PCR
Optou por trabalhar com
fragmentos menores
de dos loci VNTR, ainda, da molécula de DNA: Os STRs (loci dos microssatélites) e os LTRs (loci dos minissatélites).
Loci dos Microssatélites (STRs):
100 a 350 pares de bases comprimento
Com uma unidade de
CORE REPEAT
de 2 a 5 pares de bases
Loci dos Minissatélites (LTRs):
400 a 1.500 pares de bases de CORE REPEAT de 16 até 70 pares de base.
produtos de multiplicação durante pré-tratamento pela PCR
- podem ser separados usando-se o método de eletroforese em gel de poliacrilamida.
Detecção de fragmentos
- pode ser feita por:
FLUORESCÊNCIA
COLORAÇÃO PELA PRATA
DNAmitocondrial:
Pesquisa multilocus menos informativa que RFLP ou o teste de AmpFLP.
EM SÍNTESE:
Dependendo da quantidade e qualidade do DNA extraído da amostra - se for superior a 50 nanogramas de DNA de alto peso molecular - poderá processar-se teste de RFLP.
Ocorrido degradação do DNA (tecidos cadavéricos) AmpFLP será a saída.
Caso a degradação seja maior e a quantidade recuperada seja muito pequena, o mtDNA será a única alternativa viável.
Identificar UMA única pessoa com familiares próximos (pais ou filhos) - método de escolha: NUCLEAR.
Inexistes familiares próximos - quantidade e qualidade do DNA se mostram fracas: optar pela sequência do mtDNA nos presentes por linha materna.
A responsabilidade do Odontolegista
Deve estar preparada para colher as amostras e encaminhá-las ao laboratório competente.
Não é um mero captador e encaminhador de materiais deve ser um profissional completo na sua área de atuação.
Manuseio das Provas:
Caso não seja feito diligentemente pode inibir o DNA-estudo - devem ser conservados em envelopes
próprios (sacos de papel castanho, grosso)
Caso não respeite tal manuseio a molécula de DNA pode sofrer:
desnaturação por temperaturas elevadas;
desnaturação por pHs extremos - 4 / +13;
impedimento, pela desnaturação, de fazer uso das técnicas de RFLP;
rotura molecular por nucleases facilitada em ambientes úmidos ou molhados;
dano molecular por radiações, ultravioleta ou outras.
DNA de tecidos e Estruras Orais:
Quando se trata de tecidos moles da boca como gengiva, tonsilas, língua, coágulos sanguíneos, amostras de saliva - os materiais podem ser encaminhados ao laboratório logo depois de serem rotulados.
Quando o material deve ser extraído do interior de uma peça dentária, o CD que opera o caso deve sempre participar da decisões sobre a melhor forma de acesso ao DNA-
além de DNA os dentes tem outras utilidades em odonto lega-devemos verificar:
o dente será usado para outras pesquisas
o dente não mais será utilizado, não necessitando permanecer intacto.
O tecido mais rico em DNA:
Polpa Dentária.
Os molares por serem maior, possuem câmaras maiores - é as peças de escolha
Somente em casos eventuais
, ínfimas porções de DNA podem ser recuperados da
dentina e esmalte
- NUNCA DO ESMALTE.
Como Extrair Material para Estudo de DNA dos Dentes:
Extração dentária para estudo do DNA, algumas exigências:
Trabalhar em ambiente estéril, preservar material de contaminações;
Usar paramento cirúrgico completo;
Trabalhar, preferencialmente, em câmara estéril, com pressão positiva (ambiente adiabático-não perde e nem ganha calor);
Manter a câmara no laboratório de genética que realiza os procedimentos de exame de DNA;
Evitar a remessa ou envio de materiais entre o local de coleta e processamento preparatório e até o laboratório em que se processará o exame de DNA.
Feito as Exigências é Possível Proceder á Extração do Material - Seguindo 6 Passos Fundamentais:
1.
Remover sangue / restos de tecidos
- colocar temperatura de 4°C, caso o exame seja seja feito em menos de 6h. Caso contrário, manter em Freezer a -20°C. Se observar dessecação pulpar - passo 4=cortar o dente horizontalmente;
2.
Retirar da superfície externa do dente placa bacteriana e cálculo
- lavar com água oxigenada e depois com etanol - limpeza leve nos ápices e cáries profundas(evitar produtos químicos) - lavar com água deionizada, estéril;
Dente intacto/hígido, tirado RECENTEMENTE do alvéolo - pode ser feita uma
abordagem endodôntica convencional
- lembrar que destrói a oclusal;
Dente
DESSECADO
- cortar horizontalmente ao nível da porção cervical. Isso possibilita amplo acesso pulpar, não alterando a coroa clínica, nem a morfologia básica. Corte cinzel/disco de baixa rotação. Cinzel:dente dessecado pode fragmentar. Disco Baixa Rotação: pode aquecer a peça, prejudicar o DNA, mas pode ser evitado pela paciência.
Curetar as paredes da câmara pulpar recolhendo o tecido da polpa e o pó da abrasão
e um recipiente de boca larga- dentes dessecados a polpa pode está mumificada /pergaminácea ela deve ser irrigada com solução tampão (
TE buffer
) - os restos dentes devem ser mantidos em freezer a -20°C, caso seja preciso novos procedimentos.
Como último recurso -
trituração do dente
- melhor forma quando as outras técnicas não se mostram satisfatórias - Quando é importante conservar a coroa: cortar o dente, horizontalmente, ao nível esmalte/dentina - instrumento parte superior remover polpa e até dentina. Esmalte deixado conservando seu valor radiográfico e morfológico. Curetar metade inferior e após triturar em condições estéreis.
1- Remoção de sangue/tecidos 2- Retirar placa bacteriana/cálculo 3- Dente hígido abordagem endodôntica 4- Dente Dessecado 5- Curetar câmara pulpar/coletar pó da abrasão 6- Trituração do dente.
DNA Salivar Recuperado das Mordeduras Humanas:
Os Laboratórios utilizam amostras de saliva e de escovação da mucosa oral- como meio substitutivo muito mais simples e menos traumático com crianças. Substituição com vantagem/ menos custo/ mesma confiabilidade que as complexas Venopunções.
O DNA é isolado da saliva encontrada de escarros-bitucas de cigarro-selos de correio-todos os locais que o agente passou a língua.
Luz ultravioleta filtrada (lâmpada de WOODS): possibilita a localização sobre a pele e vestes da vítima manchas produzidas, por líquidos orgânicos saliva-sêmen-sangue
Em síntese:
A saliva humana é uma fonte importante de DNA, para uso forense.
No cadáver o DNA se mantém estável - pode ser recuperado até 48 e 60 horas após a salivação sobre a pele - depende das condições ambientais e manipulações feitas no cadáver. Depois desse lapso/tempo o DNA é contaminado pela autólise celular.
Na vítima viva: a remoção dos depósitos de saliva em regra acontece precocemente por serem lavados ou higienizados no serviço de emergência ou pronto atendimento - deve-se lembrar que o DNA da saliva seca pode ser recuperado por mais de 72h.
A contaminação pode ser um problema- os mais habituais são: sangue da própria vítima ou alheio, células desprendidas da pele da vítima - para solucionar esse inconveniente, colhe-se, por venopunção sangue periférico da vítima que permita fazer a distinção.
Técnica para colher material para pesquisa de DNA em manchas de saliva:
molhar um cotonete (swab) em água destilada.
rolar a extremidade do cotonete sobre a pele.
Deixar secar completamente, ao ar livre.
Utilizar um segundo cotonete SECO enxugar toda umidade deixada pelo primeiro.
Deixar secar completamente o segundo swab ao ar livre.
Colocar juntos os dois cotonetes encaminhado-os:
1.
analisar imediatamente no laboratório de DNA
2.
conservar no freezer a -20°C
3.
guardar em envelope para provas e transferência.