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Electroforesis en Gel de Agarosa (material (Buffers (TAE, TBE), Bromuro de…
Electroforesis en Gel de Agarosa
material
Buffers (TAE, TBE)
Bromuro de Etidio
Geles de agarosa
Bandeja de Fundición
"Peine"
Molde y Caja de Gel
Colorantes de carga (0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de cianol de xileno, 30% de glicerol)
Cables Cátodo y Ánodo
Procedimiento de preparación del gel
Derrita la mezcla de agarosa / buffer (TAE, TBE)
Agregue bromuro de etidio (EtBr)
Pese la masa apropiada de agarosa
(El azul de bromotenol se puede añadir durante la mezcla o después de que se solidifica)
Baño de agua 65° / dejar enfriar en mesa de trabajo
Coloque el gel en la bandeja de fundición y se coloca el "peine" en el molde para crear los pozos
Vierta la agarosa fundida en el molde de gel, espere a que se enfrié, ponga el gel en la caja de gel
Retire el peine y puede ser usado o guardarse a 4° C hasta su uso
Se puede ver afectado, por: :
Concentración de gel agarosa
Conformación de ADN
Tamaño de la molécula de ADN
Voltaje aplicado
Tampón de electroforesis
Precencia de bromuro de etidio
Tipo de agarosa
Precauciones
La luz ultravioleta puede causar quemaduras cuando se expone a la piel por mucho tiempo
El gel agarosa no debe pasar los 65° C
Bromuro de etidio es tóxico
Definición
Es la forma más efectiva de separar fragmentos de ADN de distintos tamaños, desde 100 pb hasta 25 kb.
Durante la gelificación, los polimeros de agarosa se asocian de forma no covalente y forma una red de haces cuyo tamaño de poro determina las propiedades de cribado molecular de un gel.
Procedimiento de separación de fragmentos de ADN
Agregue buffer a la superficie del gel
Programe el voltaje deseado
Verificar que los cables, la caja y la fuente de energía funcionen
Agregar colorante de carga a las muestras de ADN que se van a separar (azul de bromofenol, cianol de xileno y glicerol.)
Cargar las nuestras de ADN en el gel
Se tapa la caja de gel. El Cátodo (cable negro) esta mas cerca de los posos que el ánodo (cables rojos.
Haga funcionar el gel hasta que el tinte haya migrado a una distancia apropiada.