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Modificación química de enzimas (Entrecruzamiento de proteínas (Combinar…
Modificación química de enzimas
Introducción
El aumento de las aplicaciones industriales y sintéticas de las enzimas ha estimulado para incrementar su estabilidad y funcionalidad.
La modificación covalente estudió las enzimas y sus propiedades y ha sido una técnica complementaria a la mutagénesis para el diseño de enzimas.
Incorpora cofactores dentro de las proteínas, para el reemplazo de átomos a fin de generar nuevas funcionalidades (hidrolasas a peroxidasas).
Métodos
Modificación de grupos amino (NH2)
de la superficie con PEG incrementa la solubilidad en solventes orgánicos.
Ambos métodos constituyen alternativas prácticas para incrementar la estabilidad de los biocatalizadores.
Entrecruzamiento de cristales de enzimas:
con glutaraldehído genera biocatalizadores insolubles fácilmente recuperables de la mezcla de reacción.
Limitaciones
Carencia de quimio y regioselectividad de estas modificaciones,
que generan mezclas de productos heterogéneos e irreproducibles.
Se ha tratado con la introducción de una cadena lateral no natural de manera altamente quimio y regioselectiva.
Entrecruzamiento de proteínas
Combinar los efectos estabilizantes de la glicosilación y el entrecruzamiento, penicilin G acilasa y tripsina.
Ventajas:
Método fácil y no caro, aumenta la estabilidad y tolerancia a solvente orgánicos.
Inter o intramolecular con agentes bi y polifuncionales, empleando los grupos NH2 de la Lys para el proceso.
Desventajas:
Extensión y localización de las modificaciones no son claras y no se ven los cambios.
Agentes monofuncionales
Enlazamiento de funcionalidades monoméricas o poliméricas específicas.
Preparar proteínas terapéuticamente activas con
antigenicidad reducida y estabilidad in vivo incrementada
.
Introducción de fracciones pequeñas y reemplazo de átomos
La RNasa glicosilada disminuyó su actividad específica en 80% pero aumentó en estabilidad témica.
Lipasa
de
Candida rugosa
(CRL) con dietil para-nitrofenilfosfato (DPNP) fue empleada para alterar la especificidad de esta hidrolasa.
Reemplazo de átomos: Se-tripsina, Oγ nucleofílico de la Ser195 por un átomo de Se oxidativamente lávbil, exhibió buena actividad de preoxidasa.
Introducción de cofactores
Kaiser:
usando técnicas estándar de síntesis en fase sólida.
Phe8 del péptido C
derivado a partir de la RNasa S fue reemplazado por un aminoácido no natural incorporando el cofactor fosfato de piridoxamina (Vitamina B6).
Resultado:
Transaminación de piruvato a Ala asistido por iones Cu (II) 7 veces más rápido.
Combinación mutagénesis dirigida al sitio y modificación covalente
Altera propiedades catalíticas de la serin-proteasa alcalina subtilisina de
Bacillus lentus
(SBL)
Introducción de un residuo de Cys en una posición clave del sitio activo de la enzima vía mutagénesis dirigida al sitio.
Tioalquilación del residuo Cys para dar mutantes químicamente modificadas.