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Secuenciación de poteínas (Etapas: (Determinar la secuencia de cada…
Secuenciación de poteínas
Importancia:
Compara las secuencia entre proteínas homólogas de diferentes especies.
Ayuda en el desarrollo de ensayos para diagnóstico y terapias efectivas para enfermedades hereditarias.
Prerrequisito para determinar su estructura tridimensional.
Concepto:
Determinar el orden de los aminoácidos que forman esa proteína.
Objetivo:
Remover secuencialmente los aminoácidos a partir del extremo amino terminal de la cadena de proteína.
Factores:
Cantidad de proteína requerida, restricciones de tiempo y nivel de pureza.
Usos:
Identificación de nuevas proteínas, diseño de sondas para clonación molecular y manufactura de péptidos sintéticos como inmunogenes.
Métodos
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Electroforesis capilar (CE)
Electroforesis desnaturalizante con SDS-PAGE
Etapas:
Determinar la secuencia de cada fragmento.
Usar los dos grupos de secuencia para construir la secuencia de cada polipéptido.
Romper química o enzimáticamente el polipéptido en fragmentos más pequeños.
Repetir la fragmentación sin romper los enlaces disulfuro para identificar Cys.
Reducir los enlaces disulfuro (2 mercaptoetanol)
Proteasas
Endopeptidasas:
Catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos internos.
Exopeptidasas:
Catalizan la hidrólisis de los residuos N o C terminales.
Tienen requerimientos especiales en cuanto a los aminoácidos que flanquean el enlace a ser cortado.
Tripsina
Tiene gran especificidad y es el miembro más valioso de endopeptidasas usadas para fragmentar polipéptidos.
Rompe el enlace peptídico por el lado C terminal de los positivamente cargados (R y K), si el siguiente no es P
Degradación de Edman
2. Escisión:
el enlace peptídico del residuo PTC-N-terminal se separa de la cadena de polipéptido en medio ácido.
1. Enganche:
el N-terminal se engancha con el PITC bajo condiciones básicas para formar un polipéptido fenilcarbamílico (PTC).
3. Conversión:
el derivado ATZ inestable del aminoácido es convertido en el derivado estable feniltiohidantoino (PTH).
Determinación del aminoácido C-Terminal
Hidrazinólisis:
Cuando un péptido reacciona con hidracina todos los enlaces peptídicos se rompen.
Tratamiento con carboxipeptidasa:
Rompe específicamente el aminoácido C-terminal el cual puede ser aislado e identificado.
