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Exploration des proteines (II. Purification (C. Purification selon la…
Exploration des proteines
I. Concentration d'une molécule
A. Définition
La solution est mélange d'une molécule dissoute et d'un solvant polaire ou hydrophobe
concentration pondérale (g/L ou %)
Concentration molaire
mol/l, Cp/M
C. Comment préparer une solution
D. Dans les tissus
souvent les c <Km
II. Purification
A. But de la purification
séparer les proteines des autres constituants de la cellule, cristallographie, produire anticorps etc
avant la biologie on partait de la proteine pour obtenir le gène de nos jours c'est l'inverse grace au séquençage
B. Sources de purification
on utilise des levures on extrait la proteine sans dégrader avec un broyât à froid (4°C) pour éviter la protéolyse
C. Purification selon la taille
Dialyse =sépare par une membrane
La membrane est dialysante =percée de pores
Ultracentrifugation =séparer les proteines des autres constituants de la cellule
Sédimente en en fonction PM, vitesse nécessaire est proportionnelle à la masse
culot contient noyau et surnageant les éléments cytosoliques
Chromatographie par gel
Les grosses molécules arrivent en premières
D. selon la charge
Chromatographie par échange d'ions
Carboxyméthyle chargé -
Diéthylaminoéthyle chargé +
E. Selon la capacité de liaison
Chromatographie d'affinité
On utilise des ligands
La concavaline A : glycoproteine
Anticorps = pour les antigènes
Ligand = recepteurs
oligonucléotides = ADN, proteines
Reconnaissance d'une étiquette
F. Exemple purification d'un coactivateur à apprendre par coeur
G. Etape de purification a apprendre
III. Notion de PM
Poids moyen AA = 136,75
nb AA = PM X 8,42
1 kDa = 8,42 : 1 résidu AA = environ 118 Da
IV. Electrophorèse
Mobilité est inversement proportionnelle au log du PM
A. Monodimensionnelle
PM sifférents 1Kda
bleu de coomassie ou nitrate d'argent
ou radioactivité leucine au tritium ou M/C au S35
Autoradiographie
B. Bidimensionnelle
electrofocalisation suivie d'une
gel acrylamide -> charge différentes. Solution ampholytes qui crée un gradient de pH. Migrent vers leur pHi
electrophorèse SDS polyacrylamide
coupe les liaisons hydrophobes : en fonction du PM
spot proche = proteines qui diffèrent d'une modif post-trad-> change la charge voir le PM
V. Etude d'une proteine spécifique
anticorps mono ou polyclonaux
A. Dosage radio-immunologique
B. Dosage immunoenzymatique
C. Western Blot =detection et identification de proteines spécifiques
D. Immunocytochimie
révéler et cibler une molécule avec des ac spécifiques
VI. Etiquetage d'une protéine
A. But
Purifier la proteine et faire des etudes quantitatives qualitative et étudier les interactions
Utilise un vecteur comme la GFP
B. etiquettes
faire des études in-vitro, petites molécules
Faire in-vivo (peut modifier)
GFP =aqua victoria et devient fluo en présence de calcium . 27kDa avec 11 feuillet beta une helice alpha en forme de baril. Hexapeptide S,Y et G à 440 nm ca donne vert a 490
BFP Y en histidine
CFP Y en W
YFP et SFP
C. Methode FRET
interraction entre proteines
Le spectre d'emission de la 1ere proteine doit chevaucher le spectre d'aborption de la seconde
Si les proteines sont proches elles vont intéragir entre elles